Annexin V-FITCPI凋亡检测试剂盒使用原理

Annexin V-FITCPI凋亡检测试剂盒使用原理

磷脂酰丝氨酸（PS）是⼀种带负电荷的磷脂，正常细胞中，PS只分布在细胞膜脂质双层的内侧，⽽在细胞凋亡早期，细胞膜PS由脂膜内侧翻向细胞膜外侧，使PS暴露在细胞膜外表⾯。Annexin V是⼀种分⼦量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋⽩，与磷脂酰丝氨酸有⾼度亲和⼒，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被*为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之⼀。

操作说明

1. 细胞样品的准备：

a) 悬浮细胞：

1）收集细胞⾄离⼼管中1000-2000rpm离心5min，小心去除上清。

2）用1ml 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

3）再加⼊1ml 4℃预冷的PBS重悬细胞，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

b) 贴壁细胞：

1）吸出细胞培养液至离⼼管中，PBS洗涤贴壁细胞⼀次，加⼊适量不含EDTA的胰酶细胞消化液消化细胞。

2）室温孵育⾄轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，吸除胰酶细胞消化液。需避免胰酶的过度消化。

3）加⼊以上步骤中收集的细胞培养液，稍混匀，转移到离⼼管内，1000-2000rpm离⼼5min，⼩⼼吸除上清。

注：加⼊的细胞培养液一方面可以收集已经悬浮的发⽣凋亡或坏死的细胞，另一方面细胞培养液中的⾎清可以有效抑制或中和残留的胰酶；残留的胰酶会消化并降解后续加⼊的 Annexin V-FITC 导致染⾊失败。

4）⽤1ml 4℃预冷PBS轻轻重悬细胞并计数，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

5）再加⼊1ml 4℃预冷的PBS重悬细胞，1000-2000rpm离心5min，小心吸除上清。

本试剂盒将Annexin V进⾏绿⾊荧光（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为探针，利⽤荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发⽣。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是⼀种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但对凋亡中晚期的细胞和坏死细胞，PI能够透过细胞膜⽽使细胞核染红。因此采⽤Annexin V与PI双染的⽅法，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。