明胶酶谱法分析试剂盒操作时要进行哪些优化

明胶酶谱法分析试剂盒操作时要进行哪些优化

MMPs几乎能降解细胞外基质(ECM)中的各种蛋白成分,破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用，从而在肿瘤浸润转移中的作用日益受到重视，被认为是该过程中主要的蛋白水解酶。MMPs家族已分离鉴别出26个成员，编号分别为MMP1～26。根据作用底物以及片断同源性，将MMPs分为6类，为胶原酶、明胶酶、基质降解素、基质溶解素、furin活化的MMP和其他分泌型MMP。

MMP-2基因位于人类染色体16q21，由13个外显子和12个内含子所组成，结构基因总长度为27kb，与其他金属蛋白酶不同，MMP-2基因5’旁侧序列促进子区域含有2个GC盒而不是TATA盒。活化的MMP-2定位于细胞穿透基质的突出部位，估计其在酶解细胞间基质成分及基底膜的主要成分Ⅳ型胶原中有“钻头"的作用。

很多老师出现实验做不出来，那我我们针对一些常规问题，做出以下总结，希望实验中可以帮老师在解决一些问题。

1.分离胶一般是8-10%  浓缩胶一般是4%或者5% 如果几次做不好 配胶可以调一下   配胶注意的是要  摇匀  加入APS和TEMED后摇晃一下    在配胶板中均匀加入  。

2.每一块小胶电流为20 mA/gel  如果您跑2块 增加到30mA左右  胶的数量增加 电流也需要增加  一般需要跑3-6小时 电泳要慢慢跑 慢慢压 复性时间可以延长，特别是胶厚度大于0.75mm，保证尽量充分将SDS交换出来 

3. A液和B液孵育时间要长   Buffer B为37℃摇床孵育 

4.不要全部把substrate G反复冻融 常温熔化和加热 底物G 融化后取所需量加热就可以了   10倍稀释 比如分离胶体积是360ul,向里加入40ul的底物原液就可以 样本浓度低 可以上样15ul到20ul 不能超过20ul

5. 考马斯亮蓝染色后  脱色时候 要边观察边脱色 15分钟观察一下 防止脱色太厉害，看不出来

其他操作注意事项：

1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。

2.明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。

3.用大梳子

4.孵育液的PH好在7.5-7.6，复性的TRITON时间长了会有絮状物，所以实验时尽量使用新鲜配置的。

5.孵育的37度不要在CO2培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。

6、组织或者细胞的话可以用PBS，可以用低渗溶液如三分之一或者四分之一的生理盐水按照5倍体积加入后震荡裂解细胞，离心即可，步骤和提蛋白很相似即可,其实重点的步骤主要是采用低渗裂解液进行裂解，组织的话可以匀浆20-30次，然后10000转左右离心，5分钟取上清即可

另外这个实验对内参定量没有特别要求需要做

①、至于WB检测有条带，明胶酶谱检测没有条带是这样的，这两种检测方法原理都不相同。一个是检测变性条件下解离的多肽，一个是活性检测。不是说一个有条带另一个一定能检测出的。

②、关于出现其他条带，近我们也研究了，有2个解释：一个就是之前说的酶家族其他成员，另一就是酶的降解产物。