NI-NTA琼脂糖凝胶6FF缓冲液制备
金属螯合亲和层析介质,又称固定金属离子亲和色谱,其原理是利用蛋白质表面的一些氨基酸,如组氨酸能与多种过渡金属离子如Cu2+,Zn2+,Ni2+,Co2+,Fe3+发生特殊的相互作用,能够吸附富含这类氨基酸的蛋白质,从而达到分离纯化的目的。因此,偶联这些金属离子的琼脂糖凝胶就能够选择性地分离出这些含有多个组氨酸的蛋白以及对金属离子有吸附作用的多肽、蛋白和核苷酸。一般来说,Ni2+是用于纯化组氨酸标记的蛋白质的优选金属离子。半胱氨酸和色氨酸也能与固定金属离子结合,但这种结合力要远小于组氨酸残基与金属离子的结合力。镍亲和层析介质具有特异性好、流速快的优点,非常适合放大生物试剂。
Ni NTA琼脂糖凝胶6FF预先偶联Ni2+离子。通常,Ni2+是用于纯化重组组氨酸标签蛋白的优选金属离子,用咪唑进行洗脱。我们建议在含0.5-1.0 M NaCl的缓冲液,中性至弱碱性pH 7-8,这样的条件下结合,经常使用磷酸钠缓冲液。也可以使用Tris-HCl,但是在金属-蛋白质亲和力非常弱的情况下应该避免,因为它可以降低结合强度,在缓冲液中避免螯合剂如EDTA或柠檬酸盐的存在。如果重组组氨酸标签蛋白表达为包涵体,则在所有缓冲液中包括高达6M Gua-HCl或8M尿素。当使用
高浓度的尿素或Gua-HCl时,通常发生蛋白质解折叠。包涵体变性复性是个很复杂的过程,一般的建议纯化可溶蛋白。
提示:含有尿素的样品可以通过SDS-PAGE直接分析,而含有Gua-HCl的样品在SDS-PAGE之必须用尿素缓冲液置换缓冲液。
缓冲液制备
用于缓冲液制备的水和化学品应具有高纯度。使用通过0.45μm过滤器过滤缓冲液。 使用高纯度咪唑,因为这将在280nm处产生非常低的吸光度或没有吸光度。
推荐缓冲液
结合缓冲液:20mM磷酸钠,0.5M NaCl,20-40mM咪唑,pH 7.4(佳咪唑浓度是依蛋白质性质而定的,20-40mM适用于许多蛋白质)。洗脱缓冲液:20mM 磷酸钠,0.5M NaCl,500mM 咪唑,pH 7.4(洗脱所需的咪唑浓度是依蛋白质性质而定的)。
注意事项:
1.上样之,样品必须经过膜过滤及去除色素,否则杂质及色素会被吸附到填料上,影响填料的正常使用。
2.在使用过程中,避免使用高浓度的强酸强碱,酸和碱的浓度应低于 0.1 摩尔。碱会使流速变慢。
3.不同的样品,吸附和洗脱方法不相同,可以根据相关的文献进行。