1,25-Dihydroxyvitamin D 125I RIA Kit

1,25-Dihydroxyvitamin D
125I RIA Kit
For the quantitative determination of
1,25-Dihydroxyvitamin D in serum or EDTA plasma
Instruction Manual
Manuel d’Instructions
Testanleitung
Manual de Instrucciones
Manuale di Istruzioni
Bruksanvisning
Návod k použití
Brukermanual
Εγχειρίδιο οδηγιών
REF: 65100E
Stillwater, Minnesota 55082-0285, U.S.A.
0
TABLE OF CONTENTS
English ................................................................................................................ Page 1
Français .....................................................................................................................17
Deutsch.......................................................................................................................35
Español .......................................................................................................................53
Italiano.........................................................................................................................71
Svenska ......................................................................................................................88
Cesky ........................................................................................................................105
Norsk.........................................................................................................................121
Ελληνικά....................................................................................................................137
1
1,25-DIHYDROXYVITAMIN D 125I RIA KIT
1. INTENDED USE
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE.
The 1,25-Dihydroxyvitamin D 125I RIA is a competitive equilibrium radioimmunoassay
intended for the quantitative determination of 1,25-dihydroxyvitamin D (1,25-(OH)2-D) in
human serum or EDTA plasma to be used to assess 1,25-(OH)2-D deficiency
associated with renal disease. Assay results should be used in conjunction with other
clinical and laboratory data to assist the clinician in making individual patient
management decisions in adult populations.
2. SUMMARY AND EXPLANATION
Vitamin D is derived from 2 sources: exogenous (dietary) and endogenous
(biosynthesis, regulated by exposure to ultraviolet light). The exogenous or nutritional
source includes foods containing naturally low levels of vitamin D2 (e.g. milk, butter,
cereals supplemented with vitamin D2 ), nutritional supplements in the form of readily
available over-the-counter vitamins, and therapeutic formulations of the D2 vitamins.1
Vitamin D is not inherently active as it enters the circulation, by either dietary or
photochemical routes. Biological activity is gained following a complex series of
metabolic steps.2
It is now known that the metabolic activation of vitamin D is an intricay controlled
process, subject to extensive alteration by variables including dietary calcium and
phosphorus, degree of vitamin D deficiency, genetic deficiencies, parathyroid hormone
concentrations, exposure to ultraviolet light, and degree of renal function.3 The
biosynthesis of the dihydroxylated forms of vitamin D3 begins with the action of solar
ultraviolet light on 7-dehydrocholesterol to form vitamin D3 in the skin. Once vitamin D3
enters the circulation it is rapidly taken up by the liver where it is metabolized to
25-hydroxyvitamin D3 (25-OH-D3). The liver will also hydroxylate dietary vitamin D2 to
25-hydroxyvitamin D2 (25-OH-D2).2,4
Following hepatic hydroxylation, 25-OH-D is transported in association with vitamin D
binding protein to the kidney where further hydroxylation takes place. The addition of a
hydroxyl at position 1 yields 1,25-dihydroxyvitamin D (1,25-(OH)2-D). 1,25-dihydroxyvitamin
D is the most potent naturally occurring vitamin D metabolite discovered so far,
and its production is tightly regulated through concentrations of serum calcium,
phosphorus, and parathyroid hormone. During times of calcium stress, 1,25-(OH)2-D is
the most important vitamin D metabolite produced by the kidney.5,6
This is due to its essential role in the efficient active absorption of calcium and
phosphorus, as well as their normal metabolism. Consequently, the measurement of
1,25-(OH)2-D is rapidly becoming an efficient tool in the research of diseases and
conditions that affect the normal metabolism of phosphorus and calcium.7,8,9
3. PRINCIPLE OF THE ASSAY
The DiaSorin 1,25-(OH)2-D assay consists of a two-step procedure. The assay involves
a preliminary extraction and subsequent purification of vitamin D metabolites from
serum or EDTA plasma using C18OH cartridges.10 Following extraction, the treated
sample is then assayed using a competitive RIA procedure. The RIA method is based
on a polyclonal antibody that is specific for both 1,25-(OH)2 D2 and 1,25-(OH)2D3. The
sample, antibody and tracer are incubated for 2 hours at 20-25°C. Phase separation is
accomplished after a 20 minute incubation at 20-25°C with a second antibody
precipitating complex. After centrifugation and decantation, the bound fraction
remaining in the pellet is counted in a gamma counter. Values are calculated directly
from a calibrator curve of known concentrations. The final concentration of the 1,25-
(OH)2D in serum and EDTA plasma samples is expressed as pg/mL.
2
4. REAGENTS PROVIDED IN THE KIT
1,25-(OH)2D NSB BUFFER 1 vial / 3 mL
1,25-(OH)2D CALBRATOR O 1 vial / 20 mL
1,25-(OH)2D3 CALIBRATOR 1-5 5 vials / 3 mL
1,25-(OH)2D ANTISERUM 1 bottle / 35 mL
125 I 1,25-(OH)2D3 1 vial / 10 mL
1,25-(OH)2D3 PRETREATMENT SOLUTION 1 bottle / 50 mL
1,25-(OH)2D GAR PRECIPITATING COMPLEX 2 vials / 35 mL
1,25-(OH)2D CONTROL SERUM 2 vials / 3 mL
95% ETHANOL 1 vial / 7 mL
Number of tests 100
STORAGE: Upon receipt, the kit should be stored at 2-8°C. After opening, store each
reagent at 2-8°C until the expiration date on the label. Reagents should not be used
past the expiration date. The expiration date of the kit is reported on the external label
and corresponds to the expiration date of the tracer.
When reconstituting the contents of the vials, mix gently to avoid foaming. Store all
reconstituted reagents at –15°C or lower immediay following use. Reagents from
different batches must not be mixed.
4.1 1,25-(OH)2D NSB Buffer: Ready to use reagent
Potassium phosphate gelatin buffer containing ProClin 300 (< 0.2%).
4.2 1,25-(OH)2D 0 Calibrator: Ready to use reagent
Phosphate buffer containing bovine serum proteins and ProClin 300 (< 0.2%).
4.3 1,25-(OH)2D3 Calibrators (1-5): Lyophilized reagent
Five lyophilized (1,25-(OH)2D3) calibrators at concentrations ranging from 5 - 200 pg/mL
containing human serum and ProClin 300 (<0.2%). Reconstitute each calibrator with
3.0 mL of calibrator zero. Exact concentrations are stated on the vial labels. The kit
calibrators are calibrated using UV quantitation. The kit calibrators demonstrate
commutability with patient samples when used with reagents and operating procedure of
this in vitro diagnostic test as recommended.
4.4 1,25-(OH)2D Antiserum: Ready to use reagent
Rabbit anti-1,25-(OH)2D serum diluted in phosphate-gelatin buffer containing ProClin
300 (<0.2%).
4.5 125I 1,25-(OH)2D3 Ready to use reagent
Radio-iodinated 1,25-(OH)2D3 analogue diluted in an ethylene glycol phosphate buffer.
4.6 1,25-(OH)2D3 Pretreatment Solution: Ready to use reagent
Potassium phosphate buffer.
4.7 1,25-(OH)2D Controls: Level 1 (Normal), Level 2 (Elevated): Ready to use
reagent
Processed human serum pool, containing ProClin 300 (<0.2%), spiked with the
appropriate amounts of 1,25-(OH)2D to obtain control concentrations within the
specified ranges. Control 1 is within the normal range and Control 2 is within an
elevated range. The range of concentrations of each control is reported on the
certificate of analysis and indicates the limits established by DiaSorin for control values
that can be obtained in reliable assay runs.
3
4.8 Goat Anti-Rabbit (GAR) Precipitating Complex: Lyophilized reagent
Normal rabbit serum, pre-precipitated with goat anti-rabbit serum and polyethylene
glycol (PEG), is diluted in BSA-borate buffer with 0.1% sodium azide and other
preservatives added (lyophilized). Reconstitute the vial with 35 mL of distilled or
deionized water; mix thoroughly until the suspension appears homogeneous and then
allow it to stand for a minimum of 30 minutes at room temperature with occasional
mixing.
4.9 95% Ethanol: Ready to use reagent
95% ethanol and 5% water.
NOTE: C18OH cartridges are also required for this procedure. These cartridges
must be ordered separay under DiaSorin Cat. No. 65101E.
5. WARNINGS AND PRECAUTIONS
FOR IN VITRO DIAGNOSTIC USE.
Not for internal or external use in humans or animals.
CAUTION: This device is to be received, acquired, possessed, and used only by
physicians, clinical laboratories, hospitals or research facilities. Testing is to be
performed only by properly qualified and trained laboratory personnel.
REAGENTS CONTAINING HUMAN SOURCE MATERIAL
Treat as potentially infectious.
Each serum/plasma donor unit used in the preparation of this product has been tested
by an U.S. FDA approved method and found non-reactive for the presence of HBsAg,
antibody to HCV and antibody to HIV 1/2. While these methods are highly accurate,
they do not guarantee that all infected units will be detected. This product may also
contain other human source material for which there is no approved test. Because no
known test method can offer complete assurance that hepatitis B virus, hepatitis C
virus (HCV), Human Immunodeficiency Virus (HIV) or other infectious agents are
absent, all products containing human source material should be handled in
accordance with good laboratory practices using appropriate precautions as described
in the U.S. Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health
Manual, “Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,” 4th ed., May 1999
or current edition.
REAGENTS CONTAINING SODIUM AZIDE
CAUTION: Some reagents in this kit contain sodium azide. Sodium azide may react
with lead or copper plumbing to form highly explosive metal azides. On disposal, flush
with a large volume of water to prevent azide build-up. For further information, refer to
“Decontamination of Laboratory Sink Drains to Remove Azide Salts,” in the Manual
Guide-Safety Management No. CDC-22 issued by the Centers for Disease Control and
Prevention, Atlanta, GA, U.S. 1976.
European Communities Hazardous Substance Risk Phrases (Council Directive
1999/45/EC)
R20/21/22 - Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed.
R32 - Contact with acids liberates very toxic gas.
S28 - After contact with skin, wash immediay with plenty of water.
REAGENTS CONTAINING ETHANOL
European Communities Hazardous Substance Risk Phrases (Council Directive
1999/45/EC)
R11 - Highly Flammable
S16 - Keep away from sources of ignition - No smoking
S43 - In case of fire, use dry chemical or carbon dioxide
4
REAGENTS CONTAINING IODINE-125
This kit contains radioactive material which does not exceed 5.5 μCi (204 kBq) of
iodine-125. Appropriate precautions and good laboratory practices should be used in
the storage, handling, and disposal of this material.
For practitioners or institutions receiving radioisotopes under a general license:
This radioactive material may be received, acquired, possessed and used only by
physicians, veterinarians in the practice of veterinary medicine, clinical laboratories or
hospitals, and only for in vitro clinical or laboratory tests not involving internal or
external administration of the material, or the radiation therefrom, to human beings or
animals. Its receipt, acquisition, possession, use and transfer are subject to the
regulations and the general license of the U.S. Nuclear Regulatory Commission or of
the state with which the Commission has entered into an agreement for the exercise of
regulatory authority.
1. Storage of radioactive material should be limited to a specifically designated area.
2. Access to radioactive materials must be limited to authorized personnel only.
3. Do not pipette radioactive material by mouth.
4. Do not eat or drink within designated radioactive work areas.
5. Areas where spills may occur should be wiped up, then washed with an alkali
detergent or radiological decontamination solution. Any glassware used must be
rinsed compley with water before washing with other laboratory glassware.
For practitioners or institutions receiving radioisotopes under a specific license:
The receipt, use, transfer and disposal of radioactive materials are subject to the
regulations and conditions of your specific license.
WARNING: This product contains a chemical known to the State of California to cause
cancer.
ATTENTION: Radioactivity printed in the package insert may be slightly different from
the radioactivity printed on the box label and on the tracer vial label. The box label and
the tracer vial label indicate the actual amount of radioactivity at the calibration date
where the package insert indicates the theoretical radioactivity of the kit.
6. INDICATIONS OF POSSIBLE DETERIORATION OF KIT REAGENTS
6.1 The presence of abnormal particulate matter in any of the reagents.
6.2 A shift in the slope or position of the calibrator curve from what is normally
obtained.
6.3 A decrease in maximum binding.
6.4 A high nonspecific binding.
7. COLLECTION AND PREPARATION OF SERUM AND PLASMA
The 1,25-Dihydroxyvitamin D kit requires 500 μL of either serum or EDTA plasma to
perform the assay extraction; a volume of 1.5 mL will permit repeat analysis and
provide adequate pipetting volume as well.
Either human serum or plasma may be used in this kit. The anticoagulant EDTA may
be used with this assay. A fasting specimen is recommended, but not required. Blood
should be collected aseptically by venipuncture in a 5 or 10 mL evacuated glass tube.
For serum, allow the blood to clot at room temperature (15-25°C). Centrifuge for
15 minutes using approximay 760 x g* to obtain hemolysis free sera. No additives or
preservatives are required to maintain integrity of the sample. All plastics, glassware or
other material coming into contact with the specimen should be entirely free of any
contamination.
* g = (1118 x 10-8 ) (radius in cm) (rpm)2
5
Store serum or plasma samples at -15°C or lower. Samples should not be repeatedly
frozen and thawed. However, a study performed by DiaSorin showed no significant
change in values following 3 freeze-thaw cycles of the samples. Samples have been
stored at DiaSorin up to 6 months at -15°C or lower with no significant change in
results.
8. EQUIPMENT AND MATERIALS REQUIRED, BUT NOT SUPPLIED
8.1 C18OH Cartridges (24 cartridges) ordered separay under DiaSorin Cat.
No. 65101E.
8.2 Disposable borosilicate glass tubes, 12 x 75 mm and 13 x 100 mm.
8.3 Test tube rack.
8.4 Parafilm or equivalent for covering test tubes.
8.5 Foam rack for decanting or equivalent.
8.6 Centrifuge capable of accommodating 12 x 75 mm tubes and attaining
1800 x g*.
8.7 Gamma counter capable of counting 125I.
8.8 Vortex mixer.
8.9 Pipetting devices:
a. Micropipettors calibrated to deliver 75 μL, 300 μL and 500 μL.
b. Repeating dispensers capable of delivering 50 μL, 300 μL, and 500 μL.
c. Volumetric pipettes for reconstituting calibrators, 3.0 mL.
8.10 Deionized or distilled water.
8.11 Organic solvents:
The following solvents will be needed for the preparation and extraction of
samples.
Use only HPLC-grade solvents.
Do not expose any of the organic solvents to acid washed glassware or
any other acidic conditions.
a. Acetonitrile.
b. Methanol.
c. Hexane. (IMPORTANT: n-hexane percentage must be greater than 95%)
d. Methlyene chloride (must not contain alcohol as a preservative).
e. Isopropanol (2-propanol).
8.12 Recommended device for the C18OH cartridges:
a. Vac Elut sample processing station. Processes 24 columns per run.
Available from Analytichem International or DiaSorin. To order from
DiaSorin, use DiaSorin Cat. No. 11610.
8.13 Materials needed for drying samples:
a. Nitrogen gas.
b. Drying manifold with 37°C (±2°C) heating block or water bath:
N-EVAP or MULTI-VAP available through Organomation Associates (Berlin,
MA) or Reacti-Vap II and Reacti-Therm III available through Pierce Chemical
Company (Rockford, IL).
* g = (1118 x 10-8 ) (radius in cm) (rpm)2
6
9. PREPARATION OF ORGANIC SOLVENTS FOR THE COLUMN
EXTRACTION
NOTE: The Organic solvent mixtures should be prepared before starting the
Preliminary Extraction Procedure.
PRECAUTIONS:
Prepare solvent mixtures as described in TABLE I; a 500 mL volume preparation is
recommended by DiaSorin. Larger or smaller volumes can be prepared as long as the
proportions remain consistent. However, volumes should be large enough to minimize
measurement error. Measure each solvent independently for best results.
PRECAUTIONS:
Use distilled or deionized water where applicable.
TABLE I
Solvent Preparation
Solvent
Mixture Materials 1 L 500 mL
methanol 700 mL 350 mL
70:30
water 300 mL 150 mL
hexane 900 mL 450 mL
90:10
methylene chloride 100 mL 50 mL
hexane 990 mL 495 mL
99:1
IPA 10 mL 5 mL
hexane 920 mL 460 mL
92:8
IPA 80 mL 40 mL
10. PRELIMINARY EXTRACTION PROCEDURE
10.1 Reconstitute each lyophilized calibrator with 3.0 mL of calibrator zero. Mix
the calibrators well and let stand for 15-20 minutes to ensure complete
reconstitution. Thaw any frozen reagents compley. Allow all reagents to
reach room temperature. Do not allow reagents to reach temperatures above
25°C. Mix all reagents well before use.
10.2 Pipette 500 μL of each calibrator (0-5), control and patient sample into labeled
12 x 75 mm borosilicate glass tubes.
10.3 Add 500 μL of acetonitrile to each sample; vortex intermittently, at least
3 times, during a time period of 10 minutes.
10.4 Centrifuge tubes at 760 x g* for 10 minutes at 20-25°C.
10.5 Decant the sample supernatants into labeled 12 x 75 mm or 13 x 100 mm
(if preferred) test tubes; discard pellets.
10.6 Add 500 μL of Pretreatment Solution to each tube and vortex.
NOTE: This kit is designed to accommodate up to 48 extractions including the
calibrators and controls plus 40 unknowns. This means that 24 samples can
be extracted on the VacElut immediay and then the remaining set of
24 samples can be extracted afterwards. The column extractions should be
done as soon as possible after the pretreatment addition. However, once
column extracted, samples may be stored for 96 hours at -15°C or below.
10.7 The samples are now ready to be applied to the C18OH cartridges.
* g = (1118 x 10-8 ) (radius in cm) (rpm)2
7
11. COLUMN PROCEDURE
11.1 For an explanation of the VAC ELUT, refer to the VAC ELUT User’s Guide.
Assemble the station as instructed.
11.2 Label a 13 x 100 mm borosilicate glass tube for each calibrator (0-5), control,
and unknown sample. Place these tubes in the VAC ELUT. Make sure the
VAC ELUT lid is in the “WASTE” position and the tubes are positioned to
collect the desired eluates. Place the C18OH cartridges on to the VAC ELUT
cover.
11.3 Add the solvent mixtures to the specified cartridge as described in TABLE II.
IMPORTANT:
Vacuum Usage:
Turn on the vacuum after each solvent addition and allow the solvent mixture to
flow compley through the cartridge before proceeding to the next solvent. Turn
the vacuum on and off at the recommended steps in TABLE II (if preferred, the
vacuum may be turned off between each solvent addition). The vacuum should be
set at 10 inches (254 mm of Hg) or lower. Elute each solvent mixture through the
“WASTE” outlet and into appropriate waste containers until the final collection
step.
Sample Application:
The samples can either be decanted directly onto the cartridge or applied with a
pipette.
Do not let the cartridges air dry for more than 5 minutes between applications.
C18OH Cartridge Pretreatment:
The C18OH cartridges should be washed with 5 mL of 90:10 (hexane: methlyene
chloride), 5 mL of IPA and 5 mL of methanol prior to first time usage. The 90:10
(hexane: methylene chloride) solvent mixture can be prepared by measuring
900 mL of hexane and 100 mL of methylene chloride. Place the new, unused
cartridges on the VAC ELUT apparatus, set in the "WASTE" position, and add
5 mL of 90:10 (hexane: methylene chloride) followed by 5 mL of IPA to each
column and then 5 mL of methanol. Allow each solvent mixture to pass entirely
through the cartridges before proceeding to the next mixture. After this initial
preparation, it will not be necessary to repeat this step since the cartridges will be
regenerated during the extraction procedure.
NOTE: If additional samples are to be extracted (more than 24), regenerate the
cartridges using the same method outlined in TABLE II. The cartridges can be
re-used up to 30 times.
NOTE: The C18OH Cartridge material is held in place using a porous fiber frit.
Discard cartridges with dislodged or missing frits as the C18OH material may be
lost.
8
TABLE II
Description and Analysis of
Extraction
Extraction Steps Eluant Handling
1. Add 1 mL Methanol, Turn on
Vacuum.
Column
Preparation/Regeneration
Removes: Interfering substances from
previous usage (step 1) 2. Turn off Vacuum.
Discard
“WASTE”
Sample Application 3. Apply all Samples, Turn on
Vacuum. from Preliminary
Extraction Procedure (step 10).
Discard
“WASTE”
Purification/Removal of Vitamin
D Metabolites
4. Add 5 mL 70:30
Methanol/Water (deionized or
distilled).
Removes: Interfering polar lipids,
salts, and pigments (step 4)
5. Add 5 mL 90:10
Hexane/Methylene Chloride.
25(OH)D (Step 5) 6. Add 5 mL 99:1
Hexane/Isopropanol.
Remaining 25(OH)D and 24,25(OH)2
D/25,26(OH)2 D (step 6)
7. Turn off the Vacuum.
Discard
“WASTE”
Collection of 1,25-(OH)2 D IMPORTANT!
Elution of purified 1,25-(OH)2 D
(step 9)
8. Switch Vac Elut to “Collect:”
9. Add 3 mL 92:8
Hexane/Isopropanol, Turn on
the Vacuum.
10. Turn off the Vacuum.
“COLLECT”
12. DRYING AND RECONSTITUTION OF ELUATES
12.1 Place the sample tubes containing the eluates in a heating block or water bath
at 37°C (±2°C) for drying.
12.2 Dry the eluates under a hood using 2-4 psi of nitrogen gas (drying time 20-
30 minutes).
12.3 Remove the tubes immediay after the eluate has dried.
12.4 Reconstitute each of the dried extracts with 50 μL of 95% ethanol; vortex
gently at a low to medium speed. Add 125 μL of tracer into the same tubes
containing the 50 μL of 95% ethanol, vortex gently again at a low to medium
speed. NOTE: The vortex steps are very important for ensuring that the
sample has been properly reconstituted and for obtaining good precision.
CAUTION: Keep the vortex at the lower portion of the tube to prevent loss of
sample volume which will ensure sufficient pipetting volume for the assay.
Label one extra tube for Total count and one tube for NSB. Add 50 μL of 95%
ethanol and 125 μL of tracer into both tubes. These will be used to create the
TC (Total Count) and NSB duplicate tubes for the assay set up.
12.5 Perform the assay immediay after reconstituting the samples. For best
results when performing larger assays, reconstitute 12 - 15 samples at a time
and then pipette into the assay before reconstituting the next 12 - 15 samples.
9
13. ASSAY PROCEDURE
13.1 Set up labeled 12 x 75 mm disposable borosilicate glass tubes in duplicate for
each calibrator (0-5), control and sample according to scheme of the assay.
Carefully add 75 μL of the reconstituted calibrator, control, and sample
extracts into the duplicate assay tubes.
CAUTION: This step must be performed carefully since there is only 25 μL
excess in each tube.
13.2 Refer to "Drying and Reconstitution of Eluates" step number 4. Add 75 μL from
the TC (Total Count) tube into duplicate assay tubes. Repeat this step for the
NSB duplicate assay tubes as well.
13.3 Add 300 μL of NSB buffer into the NSB tubes.
13.4 Add 300 μL of primary antibody into all tubes except the Total Counts and
NSB tubes.
13.5 Mix well; incubate for 2 hours (±15 minutes) at 20-25°C.
NOTE: Reconstitute the GAR Precipitating Complex with 35 mL of distilled or
deionized water, mix thoroughly until the suspension appears homogenous
and then allow it to stand for a minimum of 30 minutes before use at room
temperature with occasional mixing before and during use.
13.6 Add 500 μL of well-mixed GAR Precipitating Complex into all tubes except the
Total Count tubes. Incubate for 20 minutes (±5 minutes) at 20-25°C.
13.7 Centrifuge all tubes for 20 minutes at 20-25°C at 1800 x g*, except the Total
Count tubes.
13.8 Decant the supernatants, except the Total Count tubes, using a foam rack
tube holder or equivalent by inverting the rack into an appropriate waste
container. Place the inverted rack onto absorbent paper for 2 - 3 minutes. Blot
the tubes gently to ensure all liquid is removed.
13.9 Measure the radioactivity by counting all tubes for 1 minute on a gamma
counter. Tubes should be counted for a minimum of 1 minute (see Limitations
of Procedure section).
14. PROCEDURAL COMMENTS
14.1 Add each aliquot of reagent to the lower third of the assay tube to ensure
complete mixture of reagents.
14.2 Correct solvent proportions are critical for good recoveries. Prepare solutions
in volumes large enough to minimize measurement error.
14.3 If any sample reads greater than the highest calibrator, it should be re-assayed
by diluting with the kit calibrator zero prior to extraction. Results should be
multiplied by the appropriate dilution factor. For example, mix
500 μL of the sample with 500 μL of the calibrator zero, then assay 500 μL of
this sample mixture as per the product insert.
14.4 No assay drift was observed in the average time it takes to perform a 100 tube
assay.
* g = (1118 x 10-8 ) (radius in cm) (rpm)2
10
14.5 In order for a laboratory to compley monitor the consistent performance of
an RIA assay, there are additional factors which may be checked. DiaSorin
suggests a regular check of the following parameters to assure consistent kit
performance.
a. Total Counts
b. Maximum Binding
Average counts per minute (CPM) of 0 calibrator tubes/Average CPM of
total count tubes.
c. Nonspecific Binding
Average CPM of the NSB tubes/Average CPM of total count tubes.
d. Slope of the Calibrator Curve
The 50% suppression can be monitored.
15. QUALITY CONTROL
Each laboratory should include at least two controls (one normal range control and one
elevated range) control in every assay to monitor kit performance. Commercially
available controls or the 2 reference controls provided with the kit may be utilized.
The controls used should be treated as unknown specimens and assayed in duplicate.
Quality control charts should be maintained by the laboratory to follow performance of
the controls. Acceptable performance limits should be determined by each individual
laboratory for each level of control using statistically based methods designed to detect
both random and systematic errors. Control results must meet the laboratory’s criteria
for acceptability prior to reporting patient test results.12,13,14
16. CALCULATION OF RESULTS
There are many methods in existence for calculating results of RIA assays. Each is
based on obtaining a calibration curve by plotting the extent of binding against stated
concentrations of the calibration calibrators. This graph may be either a linear or
logarithmic scale. Each of these methods gives essentially the same values for
controls and samples, although certain assays may “fit” better into one particular
method versus another. The calculation method for the DiaSorin Quality Control
Laboratory is a %B/B0 versus log concentration calculation method based on a Spline
Smoothed curve fit program.
16.1 Calculation of Percent B/B0
a. Calculate the average CPM for each calibrator, control and unknown
sample.
b. Subtract the average CPM of the NSB tubes from all counts.
c. Divide the average corrected CPM of each calibrator, control or unknown
sample by the average corrected CPM of the 0 calibrator and multiply by 100.
avg. CPM (Calibrator or Unknown Sample) – avg. CPM (NSB)
avg. CPM (0 Calibrator) – avg. CPM (NSB)
x 100 = B/B0 (%)
16.2 Use of Calibrator Curve Plot
a. Using 2 cycle log-logit or semi-log graph paper, plot percent B/B0 (%) for
the 1,25 (OH)2D calibrators on the ordinate (Y axis) versus the calibrator
concentration on the abscissa (X axis).
NOTE: Automated data reduction programs may also be utilized in the
analysis of data. DiaSorin utilizes Multi-Calc (Pharmacia) with a LIN-LOG
smooth-SPLINE fit program. Other data reduction methods must be
validated before incorporating for regular use.
11
b. Draw a best-fit line through the points.
c. Interpolate the levels of 1,25-(OH)2D in the samples from the plot of the
calibrators.
d. If any unknown sample has been diluted, correct for the appropriate
dilution factor.
e. The reportable range of the assay is 5.0 pg/mL to 200 pg/mL. Any value
that reads below the lowest calibrator, 5.0 pg/mL, is an extrapolated value
and may be reported as “less than 5 pg/mL”.
f. Calculate maximum binding by dividing CPM of 0 calibrator by the
average total counts obtained in the total count tubes.
Typical sample data for the 1,25-(OH)2D RIA is shown in TABLE IV and FIGURE 1; this
information is for reference only and should not be used for the calculation of any
value.
TABLE IV
DiaSorin 1,25-(OH)2D RIA Sample Data
Tube
Duplicate
CPM
Average
CPM
Corrected
CPM
Percent
Bound
(B/T)
Percent
(B/B0)
Conc.
(pg/mL)
Total Count 40,792 40,685
40,578
NSB 1,438 1,439 3.5
1,439
0 Calibrator 18,006 18,063 16,624 44.4 100.0
18,119
Calibrators
(pg/mL)
1 (5.0) 16,710 16,740 15,302 92.0
16,770
2 (15.0) 14,941 14,929 13,490 81.2
14,916
3 (30.0) 13,087 13,106 11,667 70.2
13,124
4 (75.0) 9,820 9,793 8,354 50.2
9,765
5 (200) 6,412 6,438 5,000 30.0
6,464
Controls
Level 1: 13,275 13,403 11,964 72.0 27.3
normal range 13,530
Level 2: 8,206 8,165 6,727 40.5 119
high range: 8,124
12
DiaSorin 1,25-(OH)2D RIA Sample Calibrator Curve
FIGURE 1
DATA REDUCTION
The DiaSorin QC lab uses a smoothed spline curve fit.
17. LIMITATIONS OF THE PROCEDURE
17.1 Counting times should be sufficient to prevent the introduction of error due to
counter inefficiency (for example, accumulation of 2,000 CPM will yield 5%
error, 10,000 CPM will yield 1% error).
17.2 Assay results should be used in conjunction with other clinical and laboratory data
to assist the clinician in making individualized patient management decisions.
17.3 The performance characteristics of this assay have not been established in a
pediatric population.
18. EXPECTED VALUES
Reference Interval for Normal Donors
It is important for each laboratory to establish its own reference interval representative
of its typical population. However, 1,25-(OH)2D values were collected from 123
apparently healthy volunteers from three Midwestern U.S.A cities in a clinical trial
conducted at three sites during the summer and autumn months. These 123 healthy
donors were composed of a racially diverse set of 37 males and 86 females, with an
age range of 21-68 years. The mean 1,25-(OH)2D value for the entire sample (n=123)
was 43.9 pg/mL. The 95% reference interval estimated by a nonparametric method
(following CLSI guideline C28-A215) was 25.1-66.1 pg/mL.
End-stage renal disease patients
A clinical trial was conducted to evaluate the levels of 1,25-(OH)2D that would be found
in an adult population diagnosed with end-stage renal disease. A total of 87 such
volunteers (49 males, 38 females, age range of 19-84) from three Midwestern U.S.A.
cities were collected and assayed. The observed range of 1,25-(OH)2D values for this
sample (n=87) was 1.6-17.3 pg/mL. The 95% upper reference limit estimated by the
nonparametric procedure is 14.2 pg/mL.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 10 100 1000
pg/mL
% B/Bo
13
19. SPECIFIC PERFORMANCE CHARACTERISTICS
19.1 Precision
Assay precision was evaluated by DiaSorin based on the principles of the CLSI
Guideline (EP5-A).16 Three human serum-based control levels with 1,25-(OH)2-D
concentrations distributed across the assay range were assayed over 25 assay days,
spanning more than 60 operating days. Multiple technicians, as well as multiple lot
numbers for all components were included. The combined results were evaluated by
analysis of variance (ANOVA) and are summarized in the following table.
Within-run Between Day Total
Sample N
Mean
pg/mL S.D. %CV S.D. %CV S.D. %CV
LOW 25 25.8 1.76 6.8 3.8 14.6 4.0 15.3
MID 25 41.3 3.16 7.7 4.6 11.1 5.1 12.3
HIGH 25 105.2 11.86 11.3 11.8 11.2 14.4 13.7
19.2 Trueness: The assay trueness has been checked by the linearity test and
the recovery test.
Linearity (Parallelism)
Linearity of dilution was evaluated by DiaSorin consistent with the recommendations
found in CLSI guideline, EP6-P.17 Three serum patient sample pools were prepared by
serial dilution with calibrator zero and aliquots individually frozen at –20°C. Each
sample and dilution were assayed in multiple replicates over three different assay
dates. Expected values were determined by the undiluted values of each sample pool
multiplied by the dilution factor. The data is summarized below and the composite
results plotted as a linear regression of Expected vs. Observed Value.
Sample # Dilution
Expected Value
(pg/mL) (N=10)
Mean Observed
Value (pg/mL)
(N=10)
NEAT 49.6 49.6
1:2 24.8 25.3
1:4 12.4 11.1
1
1:8 6.2 4.4
NEAT 50.2 50.2
1:2 25.1 24.2
1:4 12.6 12.2
2
1:8 6.3 4.6
NEAT 62.0 62.0
1:2 31 31.9
1:4 15.5 13.4
3
1:8 7.8 6.2
14
Recovery
The ability of the assay to quantitatively recover all of the analyte present in clinical
samples was evaluated by the addition of different amounts of freshly prepared pure
1,25-(OH)2-D antigen to three patient sample pools. Three concentrations were chosen
and assayed in duplicate, and percent recovery determined. The mean % recovery by
this method was 101%.
Sample #
Init. Conc
(pg/mL)
1.0 mL
Spike
Amount (pg)
*Expected
(pg/mL)
Observed
(pg/mL) % Recovery
50.0 77.7 75.6 97
1 30.8 62.5 88.9 87.2 98
75.0 99.8 103 103
50.0 89.2 89.5 100
2 42.8 62.5 100.3 98.9 99
75.0 111.0 118 106
50.0 86.8 83.9 97
3 40.3 62.5 97.9 103 105
75.0 108.8 118 108
*Expected concentration calculation includes dilution factor introduced by spiking
solution.
19.3 Analytical Sensitivity
The sensitivity of this assay, when defined as the lowest quantity differentiated from
zero at 2 calibrator deviations below the means cpm of the calibrator zero (n=20), has
been shown to be <2.0 pg/mL.
19.4 Analytical Specificity
Data on the cross-reactivity of the anti serum used in this kit is expressed as the ratio
of 1,25-(OH)2D3 concentration to the cross-reacting substance concentration at 50%
inhibition of maximum binding.
Analyte Conc. At 50% B/Bo % Cross Reactivity
24,25 D3 76,420 pg/mL <0.5
25,26 D3 24,330 pg/mL <0.5
25 D3 >>>1 mg/mL <0.5
19.5 Interfering Substances
An interference study was conducted to determine whether elevated levels of common
endogenous substances could negatively impact assay results. The evaluation was
consistent with CLSI guidelines (EP7-P).18 Three human serum based samples
containing low, medium or high levels of 1,25-(OH)2-D3 were tested with either
additions of the test substance or as controls spiked with identical volumes of test
substance vehicle. Each sample was extracted twice generating four replicates.
Results presented below demonstrate that there was no interference by any of the
tested substances, as determined by statistical testing by ANOVA (95% confidence
interval), or by the mean value of the spiked samples exceeding ± 2 calibrator deviation
ranges found for the controls.
15
Bilirubin
Sample #
Control
Mean
(pg/mL)
Control 2 SD
range
Bilirubin
Mean
(pg/mL)
Interference
ANOVA
Low 19.9 18.5-21.3 19.5 0.54
Mid 31.7 27.7-35.7 29.9 0.22
High 79.7 63.5-95.9 83.2 0.45
Cholesterol
Sample #
Control
Mean
(pg/mL)
Control 2 SD
range
Cholesterol
Mean
(pg/mL)
Interference
ANOVA
Low 19.9 18.5-21.3 19.4 0.64
Mid 31.7 27.7-35.7 29.7 0.15
High 79.7 63.5-95.9 75.2 0.40
Triglyceride
Sample #
Control
Mean
(pg/mL)
Control 2 SD
range
Triglyceride
Mean
(pg/mL)
Interference
ANOVA
Low 14.7 12.9-16.5 15.1 0.88
Mid 30.4 22.4-38.4 33.4 0.25
High 92.6 69.5-116.9 95.4 0.68
Hemoglobin
Sample #
Control
Mean
(pg/mL)
Control 2 SD
range
Hemoglobin
Mean
(pg/mL)
Interference
ANOVA
Low 21.5 17.5-25.5 20.8 0.53
Mid 38.6 35.4-41.8 40.0 0.43
High 112.7 101.4-124.0 120.6 0.17
Urea
Sample #
Control
Mean
(pg/mL)
Control 2 SD
range
Urea Mean
(pg/mL)
Interference
ANOVA
Low 25.1 20.9-29.3 26.6 0.39
Mid 36.2 23.8-48.6 35.9 0.96
High 120.1 97.4-142.8 118.6 0.82
REFER TO LAST PAGE FOR REFERENCES
16
SCHEME OF THE ASSAY
1. The calibrators, controls and unknowns are all reconstituted with 95% ethanol
and tracer after the column procedure dry down step.
2. Dispense reagents according to the following scheme:
Tubes/Reagents
Total
Counts NSB
Cal
0-5
Controls and
unknown samples
Reconstituted Calibrators - - 75 μL -
Reconstituted Controls and
Unknown Samples - - - 75 μL
95% Ethanol and Tracer ** 75 μL 75 μL - -
NSB Buffer - 300 μL - -
1,25-(OH)2-D Antiserum - - 300 μL 300 μL
NOTE: Total count and NSB tubes are created by adding 50 μL of 95% ethanol with
125 μL of tracer and pipetting 75 μL of this mixture into duplicate assay tubes.
3. Mix well; incubate for 2 hours (+/- 15 minutes) at 20-25°C.
4. Dispense 500 μL of GAR precipitating reagent into all wells, except the total
count tubes.
5. Mix well; incubate for 20 minutes (+/- 5 minutes) at 20-25°C.
6. Centrifuge using 1800 x g* for 20 minutes at 20-25°C.
7. Decant the supernatants.
8. Count each tube in a gamma counter for 1 minute.
*g = (1118 x 10-8) (radius in cm) (rpm)2
17
TROUSSE DE DOSAGE RADIO-IMMUNOLOGIQUE
1,25-DIHYDROXYVITAMINE D 125I
1. INDICATION
POUR USAGE DIAGNOSTIQUE IN VITRO.
La trousse de dosage radio-immunologique 1,25-Dihydroxyvitamine D 125I est un
dosage radio-immunologique de l'équilibre de compétition qui permet la détermination
quantitative de la 1,25-dihydroxyvitamine D (1,25-(OH)2-D) dans le sérum humain ou le
plasma sur EDTA afin d'évaluer la carence en 1,25-(OH)2-D qui est associée avec les
maladies rénales. Les résultats du dosage doivent être utilisés avec d'autres données
cliniques et d'analyse pour aider le clinicien à prendre des décisions individuelles de
traitement de l'adulte.
2. RÉSUMÉ ET COMMENTAIRE
La vitamine D est dérivée de 2 sources : exogène (aliments) et endogène
(biosynthèse, régulée par l'exposition à la lumière ultraviolette). La source exogène ou
nutritionnelle inclut les aliments contenant des taux naturellement faibles de vitamine
D2 (par exemple le lait, le beurre, les céréales enrichies avec de la vitamine D2), les
suppléments nutritionnels sous forme de vitamines en vente libre et les formulations
thérapeutiques des vitamines D2 .1 La Vitamine D ne possède pas une activité
inhérente quand elle entre dans le sang, par des voies alimentaires ou
photochimiques. L'activité biologique est obtenue après après une série complexe
d'étapes métaboliques.2
On sait que l'activation métabolique de la vitamine D est un procédé contrôlé
extrêmement compliqué qui varie beaucoup en fonction de certaines variables Comme
le taux de calcium et phosphore dans l'alimentation, le degré de carence en vitamine
D, les déficits génétiques, les concentrations d'hormone parathyroïdienne, l' exposition
à la lumière ultraviolette et le fonctionnement rénal.3 La biosynthèse des formes
dihydroxylées de la vitamine D3 commence avec l'action de la lumière ultraviolette du
soleil sur le 7-déhydrocholestérol pour former la vitamine D3 dans la peau. Dès que la
vitamine D3 entre dans le sang, elle est rapidement absorbée par le foie où elle
est métabolisée en 25-hydroxyvitamine D3 (25-OH-D3). Le foie effectue aussi
l'hydroxylation de la vitamine D2 présente dans les aliments en 25-hydroxyvitamine D2
(25-OH-D2).2,4
Après l'hydroxylation hépatique, le 25-OH-D est transporté, avec la protéine fixatrice de
la vitamine D, dans les reins où une autre hydroxylation a lieu. L'addition d'un groupement
hydroxyle à la position 1 produit la 1,25-dihydroxyvitamine D (1,25-(OH)2-D). La
1,25-dihydroxyvitamine D est le métabolite naturel le plus actif de la vitamine D
découvert jusqu'à ce jour, et sa production est étroitement régulée par l'intermédiaire
des concentrations de calcium, phosphore et de l'hormone parathyroïdienne dans le
sérum. Pendant les périodes de stress calcique, la 1,25-(OH)2-D est le métabolite de la
vitamine D le plus important produit par les reins.5,6
Cela s'explique par son rôle essentiel dans l'absorption active efficace du calcium et du
phosphore, ainsi que leur métabolisme normal. Par conséquent, la mesure de 1,25-
(OH)2-D devient rapidement un outil efficace dans l'étude des maladies et conditions
qui affectent le métabolisme normal du phosphore et du calcium.7,8,9
18
3. DESCRIPTION DE LA METHODE DE DOSAGE
Le dosage DiaSorin 1,25-(OH)2-D est une procédure en deux temps. Le dosage
comporte une extraction préliminaire suivie d'une purification des métabolites de la
vitamine D dans le sérum ou le plasma sur EDTA en utilisant des cartouches
C18OH.10 Suite à l'extraction, l'échantillon traité est ensuite dosé par RIA de
compétition. La méthode RIA repose sur un anticorps polyclonal spécifique de 1,25-
(OH)2 D2 et 1,25-(OH)2D3. L'échantillon, l'anticorps et le traceur sont incubés pendant
2 heures entre 20 et 25°C. La séparation en phases s'accomplit au bout de 20 minutes
d' incubation entre 20 et 25°C produisant un second complexe d'anticorps précipitant.
Après centrifugation et décantation, la fraction fixée restant dans le granulé est
mesurée à l'aide d'un compteur gamma. Les valeurs sont calculées directement à
l'aide d'une courbe d'étalonnage obtenue avec des concentrations connues. La
concentration finale de 1,25-(OH)2D dans les échantillons de sérum et plasma sur
EDTA est exprimée en pg/mL.
4. RÉACTIFS FOURNIS DANS LA TROUSSE
TAMPON NSB 1,25-(OH)2D 1 tube / 3 mL
ÉTALON 0 1,25-(OH)2D 1 tube / 20 mL
ÉTALON 1-5 1,25-(OH)2D3 5 tubes / 3 mL
ANTISÉRUM 1,25-(OH)2D 1 flacon / 35 mL
125 I 1,25-(OH)2D3 1 tube / 10 mL
SOLUTION DE PRÉTRAITEMENT 1,25-(OH)2D3
1 flacon / 50 mL
COMPLEXE PRÉCIPITANT GAR 1,25-(OH)2D 2 tubes / 35 mL
SÉRUM DE CONTRÔLE 1,25-(OH)2D 2 tubes / 3 mL
ÉTHANOL 95% 1 tube / 7 mL
Nombre de dosages 100
CONSERVATION : Dès réception, la trousse doit être stockée entre 2 et 8°C. Après
ouverture, conserver chaque réactif entre 2 et 8°C jusqu'à la date de péremption indiquée
sur l'étiquette. Les réactifs ne doivent pas être utilisés au-delà de la date de
péremption. La date de péremption de la trousse se trouve sur l'étiquette extérieure et
correspond à celle du traceur.
Pendant la reconstitution du contenu des tubes, agiter délicatement pour éviter la
formation de mousse. Après utilisation, conserver tous les réactifs reconstitués à une
température inférieure ou égale à –15°C. Les réactifs de lots différents ne doivent pas
être mélangés.
4.1 Tampon NSB 1,25-(OH)2D : réactif prêt à l'emploi
Tampon de gélatine de phosphate-potassium contenant ProClin 300 (< 0,2%).
4.2 Étalons 0 1,25-(OH)2D : Réactif prêt à l'emploi
Tampon phosphate contenant des protéines bovines sériques et ProClin 300
(< 0,2%).
4.3 Étalons (1-5) 1,25-(OH)2D3 : Réactif lyophilisé
Cinq étalons lyophilisés (1,25-(OH)2D3) à des concentrations comprises entre 5 et
200 pg/mL contenant du sérum humain et ProClin 300 (<0,2%). Reconstituer chaque
étalon avec 3,0 mL d'étalon zéro. Les concentrations exactes apparaissent sur les
étiquettes des tubes. Les étalons de la trousse sont calibrés par quantification UV. Les
étalons de la trousse démontrent leur commutabilité avec les échantillons patient
lorsqu'ils sont utilisés avec les réactifs et selon le mode d'emploi de ce dosage
diagnostique in vitro, comme recommandé.
19
4.4 Antisérum 1,25-(OH)2D : Réactif prêt à l'emploi
Du sérum de lapin anti-1,25-(OH)2D est dilué dans un tampon de gélatine de
phosphate contenant ProClin 300 (<0,2%).
4.5 125I 1,25-(OH)2D3 Réactif prêt à l'emploi
Analogue radio-iodé 1,25-(OH)2D3 dilué dans un tampon d'éthylène glycol-phosphate.
4.6 Solution de prétraitement 1,25-(OH)2D3 : Réactif prêt à l'emploi
Tampon potassium-phosphate.
4.7 Contrôles 1,25-(OH)2D : Niveau 1 (Normal), Niveau 2 (Élevé) : Réactif prêt à
l'emploi
Les échantillons de sérum humain analysés, contenant ProClin 300 (<0,2%), dopés
avec les quantités appropriées de 1,25-(OH)2D pour obtenir des concentrations de
contrôle comprises dans les intervalles spécifiés. Le Contrôle 1 est compris dans
l'intervalle normal et le Contrôle 2 est compris dans un intervalle élevé. La plage de
concentrations pour chaque contrôle est indiquée dans le certificat d’analyse et indique
les limites établies par DiaSorin pour les valeurs de contrôle qui peuvent être obtenues
dans des séries analytiques fiables.
4.8 Complexe précipitant anti-lapin de chèvre (GAR) : Réactif lyophilisé
Sérum de lapin normal, pré-précipité avec du sérum anti-lapin de chèvre et du
polyéthylène glycol (PEG), est dilué dans un tampon d'albumine bovine-borate
contenant 0,1% d'azide de sodium et d'autres conservateurs (lyophilisés). Reconstituer
le tube avec 35 mL d'eau distillée ou déminéralisée ; mélanger soigneusement jusqu'à
ce que la suspension apparaisse homogène et laisser reposer pendant 30 minutes
minimum à température ambiante ; mélanger de temps en temps.
4.9 Éthanol 95% : Réactif prêt à l'emploi
95% éthanol et 5% eau.
REMARQUE : Les cartouches C18OH sont également requises pour ce dosage.
Commander ces cartouches séparément sous la référence DiaSorin 65101E.
5. AVERTISSEMENTS ET PRÉCAUTIONS
POUR USAGE DIAGNOSTIQUE IN VITRO.
Non prévu pour une utilisation interne ou externe sur l'homme ou l'animal.
ATTENTION : Ce dispositif doit être reçu, réceptionné, détenu et utilisé uniquement
par des médecins, des laboratoires cliniques, des hôpitaux et des centres de
recherche.
Les analyses doivent être effectuées uniquement par un personnel de laboratoire
correctement qualifié et formé.
RÉACTIFS CONTENANT DES PRODUITS D'ORIGINE HUMAINE
Traiter comme potentiellement infectieux.
Chaque don de sérum/plasma intervenant dans la préparation de ce produit a été testé
par une méthode agréée par la U.S.FDA et s'est avéré non réactif en présence de
HBsAg, d'anticorps anti-VHC et d'anticorps anti-VIH1/2. Même si ces méthodes sont
extrêmement précises, elles ne garantissent pas la détection de tous les dons infectés.
Ce produit peut également contenir d'autres produits d'origine humaine pour lesquelles
il n'existe aucun test agréé. Comme aucune méthode de test connue ne peut offrir
l'assurance complète de l'absence du virus de l'hépatite B, de l'hépatite C (HCV), du
virus de l'immunodéficience humaine (VIH) ou d'autres agents infectieux, tous les
produits d'origine humaine doivent être manipulés conformément aux bonnes pratiques
de laboratoire en prenant les précautions appropriées décrites dans le document U.S.
Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health Manual,
“Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories,” 4ème éd., mai 1999 ou
dernière édition.
20
RÉACTIFS CONTENANT DE L'AZIDE DE SODIUM
ATTENTION : Certains réactifs de cette trousse contiennent de l'azide de sodium.
L'azide de sodium peut réagir avec la plomberie en plomb ou en cuivre et former des
azotures ultra-explosifs. Pour leur mise au rebut, rincer à grande eau pour empêcher
l'accumulation d'azide. Pour plus d'informations, consulter “Decontamination of
Laboratory Sink Drains to Remove Azide Salts,” dans le manuel Guide-Safety
Management No. CDC-22 publié par les Centers for Disease Control and Prevention,
Atlanta, GA, U.S. 1976.
Déclaration des risques relatifs aux substances dangereuses des communautés
européennes (Directive du conseil 1999/45/EC)
R 20/21/22 - Nocif en cas d'inhalation, d'ingestion et de contact avec la peau.
R 32 - Un contact avec les acides dégage des gaz très toxiques.
S28 - Après un contact avec la peau, laver immédiatement à grande eau.
RÉACTIFS CONTENANT DE L'ÉTHANOL
Déclaration des risques relatifs aux substances dangereuses des communautés
européennes (Directive du conseil 1999/45/EC)
R11 - Hautement inflammable
S16 - Tenir à l'écart de sources d'inflammation - Interdiction de fumer.
S43 - En cas d'incendie, utiliser une poudre extinctrice ou du gaz carbonique
RÉACTIFS CONTENANT DE L'IODE 125
Cette trousse contient un produit radioactif qui ne dépasse pas 5,5 μCi (204 kBq)
d'iode 125. Les précautions appropriées et les bonnes pratiques de laboratoire doivent
être utilisées pour la conservation, la manipulation et la mise au rebut de ce produit.
Pour les praticiens ou les établissements recevant des radio-isotopes dans le cadre
d'une licence générale :
Ce produit radioactif peut être reçu, réceptionné, détenu et utilisé uniquement par des
médecins, des laboratoires cliniques et des hôpitaux et uniquement pour des analyses
cliniques ou de laboratoire in vitro n'impliquant pas l'administration interne ou externe
du produit, ni par rayonnement, à l'homme ou à l'animal. Sa réception, son acquisition,
sa détention, son utilisation et son transfert sont sujets aux réglementations et à la
licence générale de l'U.S. Nuclear Regulatory Commission de l'État avec lequel la
Commission a conclu un accord pour l'exercice de l'autorité réglementaire.
1. Le produit radioactif doit être conservé dans un endroit désigné.
2. L'accès aux produits radioactifs doit être limité au personnel autorisé uniquement.
3. Ne pas pipeter des solutions radioactives avec la bouche.
4. Ne pas manger, ni boire dans les zones de travail radioactives.
5. En cas de déversement de produits radioactifs dans une zone, nettoyer la zone,
puis la laver à l'aide d'un produit détergent à base d'alcali ou d'une solution de
décontamination radiologique. Tout article en verre utilisé doit être entièrement
lavé à l'eau avant de laver les autres articles en verre du laboratoire.
Pour les praticiens ou les établissements recevant des radio-isotopes dans le cadre
d'une licence spécifique :
La réception, l'utilisation, le transfert et la mise au rebut de produits radioactifs sont
sujets aux réglementations et conditions de votre licence spécifique.
AVERTISSEMENT : Ce produit contient un produit chimique connu dans l'Etat de
Californie comme étant cancérigène.
ATTENTION : La radioactivité imprimée sur la notice d'utilisation peut être légèrement
différente de celle qui est imprimée sur l'étiquette de la boîte et sur l'étiquette du flacon
du traceur. Les étiquettes de la boîte et du flacon du traceur indiquent la dose réelle de
radioactivité à la date de calibrage, alors que la notice d'utilisation indique la
radioactivité théorique de la trousse.
21
6. INDICATIONS D'UNE DÉTÉRIORATION POSSIBLE DES RÉACTIFS DE LA
TROUSSE
6.1 Présence de particules anormales dans l'un quelconque des réactifs.
6.2 Écart de pente ou de position de la courbe d'étalonnage par rapport à la
normale obtenue.
6.3 Diminution de la liaison maximale.
6.4 Haute liaison non spécifique
7. PRÉLÈVEMENT ET PRÉPARATION DU SÉRUM ET DU PLASMA
500 μL de sérum ou de plasma sur EDTA sont nécessaires pour l'extraction avec la
trousse 1,25-Dihydroxyvitamine D; un volume de 1,5 mL permettra les doublets
d'analyse et un volume de pipetage adéquat.
Du sérum ou du plasma humain peut être utilisé dans cette trousse. L'EDTA peut être
utilisé comme anticoagulant avec ce dosage. Un échantillon à jeun est recommandé,
mais pas obligatoire. Le sang doit être prélevé de manière aseptique par ponction
veineuse dans un tube en verre à vide de 5 ou 10 mL. Dans le cas du sérum, laisser
le sang coaguler à température ambiante (15 à 25°C). Centrifuger pendant 15 minutes
à 760 x g* environ pour obtenir du sérum sans hémolyse. Aucun additif ou
conservateur n'est requis pour maintenir l'intégrité de l'échantillon. Tous les plastiques,
articles en verre ou autres produits entrant en contact avec l'échantillon ne doivent
absolument pas être contaminés.
Conserver les échantillons de sérum ou de plasma à -15°C maximum. Ne pas congeler
un échantillon qui a été décongelé. Cependant, une étude menée par DiaSorin n'a pas
mis en évidence un changement significatif des valeurs après 3 cycles de congélationdécongélation
des échantillons. Les échantillons ont été stockés à DiaSorin pendant 6
mois maximum à des températures inférieures ou égales à -15°C et les résultats
obtenus n'ont pas été significativement différents.
8. MATÉRIEL ET PRODUITS REQUIS MAIS NON FOURNIS
8.1 Cartouches C18OH (24 cartouches) à commander séparément sous la
référence DiaSorin 65101E.
8.2 Tubes en verre borosilicaté jetables, 12 x 75 mm et 13 x 100 mm.
8.3 Portoir de tubes à essai.
8.4 Parafilm ou équivalent pour couvrir les tubes à essai.
8.5 Râier en mousse ou équivalent pour décanter.
8.6 Centrifugeuse pour tubes 12 x 75 mm pouvant atteindre 1800 x g*.
8.7 Compteur gamma capable de compter 125I.
8.8 Agitateur-mélangeur vortex.
8.9 Pipettes :
a. Micropipettes calibrées pour distribuer 75 μL, 300 μL et 500 μL.
b. Distributeurs à répétition capables de distribuer 50 μL, 300 μL et 500 μL.
c. Pipettes volumétriques pour la reconstitution des étalons, 3,0 mL.
8.10 Eau déminéralisée ou distillée.
8.11 Solvants organiques :
Les solvants suivants sont requis pour préparer et extraire les échantillons.
Utiliser uniquement des solvants pour CLHP.
*g = (1118 x 10-8) (rayon en cm) (tr/min)2
22
Ne pas mettre les solvants organiques en contact avec des articles en
verre lavés avec un acide ou d'autres milieux acides.
a. Acétonitrile.
b. Méthanol.
c. Hexane. (IMPORTANT: le n-hexane doit avoir un pourcentage supérieur
à 95%)
d. Chlorure de méthylène (ne doit pas contenir un alcool comme conservateur).
e. Isopropanol (2-propanol).
8.12 Appareil recommandé pour les cartouches C18OH :
a. Station de traitement de l'échantillon Vac Elut. Analyse 24 colonnes par
dosage. Peut être commandée chez Analytichem International ou
DiaSorin. Pour commander chez DiaSorin, utiliser la référence DiaSorin
11610.
8.13 Produits requis pour sécher les échantillons :
a. Azote gazeux.
b. Chambre de séchage avec unité chauffante à 37°C (±2°C) ou un bain
d'eau :
N-EVAP ou MULTI-VAP commercialisé par Organomation Associates
(Berlin, MA) ou Reacti-Vap II et Reacti-Therm III commercialisé par Pierce
Chemical Company (Rockford, IL).
9. PRÉPARATION DES SOLVANTS ORGANIQUES POUR LA COLONNE D'
EXTRACTION
REMARQUE : Les mélanges de solvants organiques doivent être préparés avant
de démarrer l'extraction préliminaire.
PRÉCAUTIONS :
Préparer les mélanges de solvants conformément au TABLEAU I ; DiaSorin recommande
de préparer un volume de 500 mL. Des volumes supérieurs ou inférieurs
peuvent être préparés tant que les proportions restent constantes. Les volumes doivent
cependant être suffisamment grands pour minimiser les erreurs de mesure. Pour
obtenir des résultats optimaux, mesurer chaque solvant indépendamment.
PRÉCAUTIONS :
Utiliser de l'eau distillée ou déminéralisée quand nécessaire.
TABLEAU I
Préparation du solvant
Mélange des solvants Produits 1 L 500 mL
méthanol 700 mL 350 mL
70:30 eau 300 mL 150 mL
hexane 900 mL 450 mL
90:10 chlorure de méthylène 100 mL 50 mL
hexane 990 mL 495 mL
99:1 IPA 10 mL 5 mL
hexane 920 mL 460 mL
92:8 IPA 80 mL 40 mL
23
10. EXTRACTION PRÉLIMINAIRE
10.1 Reconstituer chaque étalon lyophilisé avec 3,0 mL d'étalon zéro. Bien
mélanger les étalons et laisser reposer entre 15 et 20 minutes pour garantir
une reconstitution complète. Décongeler complètement les réactifs congelés.
Laisser tous les réactifs atteindre la température ambiante. Ne pas laisser les
réactifs atteindre une température supérieure à 25°C. Bien mélanger tous les
réactifs avant de les utiliser.
10.2 Pipeter 500 μL de chaque étalon (0-5), contrôle et échantillon patient dans des
tubes en verre borosilicaté et étiquetés de 12 x 75 mm.
10.3 Ajouter 500 μL d'acétonitrile dans chaque échantillon ; agiter par intermittence,
au moins 3 fois, pendant 10 minutes.
10.4 Centrifuger les tubes à 760 x g* pendant 10 minutes entre 20 et 25°C.
10.5 Décanter les surnageants dans des tubes à essai étiquetés de 12 x 75 mm ou
13 x 100 mm (selon la préférence) ; éliminer les granulés.
10.6 Ajouter 500 μL de solution de prétraitement dans chaque tube et agiter dans le
Vortex.
REMARQUE : Cette trousse permet d'effectuer jusqu'à 48 extractions y
compris les étalons et contrôles plus 40 inconnus. 24 échantillons peuvent
donc être extraits immédiatement sur le VacElut et les 24 échantillons restants
peuvent être extraits après. Les extractions sur la colonne doivent être
effectuées le plus rapidement possible après l'addition du prétraitement.
Cependant, une fois que la colonne est extraite, les échantillons peuvent être
stockés pendant 96 heures à des températures inférieures ou égales à -15°C.
10.7 Les échantillons sont maintenant prêts à être déposés sur les cartouches
C18OH.
11. PROCÉDURE AVEC LA COLONNE
11.1 Pour une explication sur le fonctionnement de VAC ELUT, consulter le guide
de l'utilisateur VAC ELUT. Assembler la station en suivant les instructions.
11.2 Étiqueter un tube en verre borosilicaté de 13 x 100 mm pour chaque étalon
(0-5), contrôle et échantillon inconnu. Mettre ces tubes dans le VAC ELUT.
Vérifier que le couvercle du VAC ELUT est en position “DÉCHETS” et que les
tubes sont placés correctement pour récupérer les éluats souhaités. Mettre les
cartouches C18OH sur le couvercle du VAC ELUT.
11.3 Ajouter les mélanges de solvants dans la cartouche indiquée conformément
au TABLEAU II.
IMPORTANT :
Utilisation du vide :
Mettre le vide après chaque addition de solvant et laisser le mélange de solvants
couler complètement à travers la cartouche avant d'utiliser le solvant suivant.
Mettre le vide et fermer le vide aux étapes recommandées dans le TABLEAU II
(Si on préfère, le vide peut être mis ou fermé entre chaque addition de solvant).
Le vide doit avoir une pression inférieure ou égale à 254 mm de Hg. Éluer chaque
mélange de solvants à travers la sortie “DÉCHETS” et dans les récipient à
déchets appropriés jusqu'à l'étape finale de récupération.
*g = (1118 x 10-8) (rayon en cm) (tr/min)2
24
Application à l'échantillon :
Les échantillons peuvent être décantés directement sur la cartouche ou déposés
avec une pipette.
Ne pas laisser la cartouche sécher à l'air pendant plus de 5 minutes entre les
applications.
Prétraitement de la cartouche C18OH :
Les cartouches C18OH doivent être lavées avec 5 mL de 90:10 (hexane : chlorure
de méthylène), 5 mL d'IPA et 5 ml d'éthanol avant leur première utilisation. Le
mélange de solvants 90:10 (hexane : chlorure de méthylène) peut être préparé en
mesurant 900 mL d'hexane et 100 mL de chlorure de méthylène. Mettre les
cartouches neuves sur le VAC ELUT, en position “DÉCHETS”, et ajouter 5 mL de
90:10 (hexane : chlorure de méthylène) suivis de 5 mL d'IPA sur chaque colonne
puis 5 mL de méthanol. Laisser chaque mélange de solvants traverser
complètement les cartouches avant d'utiliser le mélange suivant. Après cette
préparation initiale, il ne sera pas nécessaire de répéter cette étape puisque les
cartouches seront régénérées pendant l'extraction.
REMARQUE : Dans le cas d'extraction d'échantillons supplémentaires (plus de
24), régénérer les cartouches en utilisant la même procédure décrite dans le
TABLEAU II. Les cartouches peuvent être utilisées jusqu'à 30 fois.
REMARQUE : Le produit dans les cartouches C18OH est maintenu en place à
l'aide d'une composition de fibres poreuses. Éliminer les cartouches avec des
compositions déplacées ou manquantes car du produit C18OH peut avoir été
perdu.
25
TABLEAU II
Description et analyse de
l'extraction
Étapes de l'extraction Manipulation de
l'éluant
1. Ajouter 1 mL de méthanol,
mettre le vide.
Préparation/Régénération de la
colonne Élimine : les substances
interférantes provenant de son utilisation
précédente
(étape 1)
2. Fermer le vide.
Éliminer
“DÉCHETS”
Application à l'échantillon
3. Déposer tous les échantillons,
mettre le vide. voir la procédure
d'extraction préliminaire (étape
10).
Éliminer
“DÉCHETS”
Purification/Élimination
des métabolites de la vitamine D
4. Ajouter 5 mL de 70:30
Méthanol/Eau (déminéralisée
ou distillée).
Élimine : Les lipides polaires
interférants, sels et pigments
(étape 4)
5. Ajouter 5 mL de 90:10
Hexane/Chlorure de
méthylène.
25(OH)D (Étape 5)
6. Ajouter 5 mL de 99:1
Hexane/ Isopropanol.
25(OH)D et 24,25(OH)2 D/25,26(OH)2 D
restants (étape 6)
7. Fermer le vide.
Éliminer
“DÉCHETS”
Récupération du 1,25-(OH)2 D IMPORTANT!
Élution du 1,25-(OH)2 D purifié
(étape 9)
8. Mettre le Vac Elut en
position “Récupération :”
9. Ajouter 3 mL de 92:8
Hexane/Isopropanol,
mettre le vide.
10. Fermer le vide.
“RÉCUPÉRATION”
12. SÉCHAGE ET RECONSTITUTION DES ÉLUATS
12.1 Placer les tubes échantillons contenant les éluats dans une unité chauffante
ou bain d'eau à 37°C (±2°C) pour les sécher.
12.1 Sécher les éluats sous une hotte avec de l'azote gazeux à 2-4 psi (durée de
séchage 20-30 minutes).
12.3 Enlever les tubes dès que l'éluat est sec.
12.4 Reconstituer chaque extrait sec avec 50 μL d'éthanol 95%; agiter délicatement
dans le vortex en utilisant une vitesse lente à moyenne. Ajouter 125 μL de
traceur dans les mêmes tubes contenant 50 μL d'éthanol 95%, agiter délicatement
dans le vortex en utilisant une vitesse lente à moyenne. REMARQUE :
Les étapes d'agitation sont très importantes car elles permettent de garantir la
bonne reconstitution de l'échantillon ainsi qu'une bonne précision.
ATTENTION: Limiter l'agitation à la portion inférieure du tube pour éviter de
perdre de l'échantillon et permettre le pipetage suffisant du volume pour le
dosage. Étiqueter un tube supplémentaire pour la numération totale et un tube
pour NSB. Ajouter 50 μL d'éthanol 95% et 125 μL de traceur dans les deux
tubes. Ils vont être utilisés pour créer les tubes de NT (numération totale) et
NSB en doublets pour le dosage.
26
12.5 Effectuer le dosage immédiatement après la reconstitution des échantillons.
Pour obtenir des résultats optimaux lors des dosages plus grands,
reconstituer 12 - 15 échantillons à la fois puis pipeter pour le dosage avant de
reconstituer les 12 - 15 échantillons suivants.
13. PROCÉDURE DE DOSAGE
13.1 Installer des tubes en verre borosilicaté jetables de 12 x 75 mm étiquetés en
doublets pour chaque étalon (0-5), contrôle et échantillon selon le profil de
dosage. Ajouter lentement 75 μL d'étalon reconstitué, du contrôle et des
extraits échantillons dans les tubes de dosage en doublets.
ATTENTION Faire attention à cette étape car il n'y a que 25 μL de solution en
excès dans chaque tube.
13.2 Se référer à l'étape numéro 4 “Séchage et reconstitution des éluats”. Ajouter
75 μL du tube de NT (Numération totale) dans les tubes de dosage en
doublets. Répéter cette étape avec les tubes de dosage NSB en doublets.
13.3 Ajouter 300 μL de tampon NSB dans les tubes NSB.
13.4 Ajouter 300 μL d'anticorps primaire dans tous les tubes à l'exception des tubes
de numération totale et NSB.
13.5 Bien mélanger ; incuber pendant 2 heures (±15 minutes) entre 20 et 25°C.
REMARQUE : Reconstituer le complexe précipitant GAR avec 35 mL d'eau
distillée ou déminéralisée, bien mélanger jusqu'à ce que la suspension
apparaissent homogène puis laisser reposer pendant 30 minutes minimum
avant de l'utiliser à température ambiante. Mélanger de temps en temps avant
et pendant l'utilisation.
13.6 Ajouter 500 μL de complexe précipitant GAR bien mélangé dans tous les
tubes à l'exception des tubes de numération totale. Incuber pendant
20 minutes (±5 minutes) entre 20 et 25°C.
13.7 Centrifuger tous les tubes pendant 20 minutes entre 20 et 25°C à 1800 x g*,
à l'exception des tubes de numération totale.
13.8 Décanter les surnageants, à l'exception des tubes de numération totale, sur un
râier en mousse ou équivalent en inversant le râier dans un récipient à
déchets appropriés. Placer le râier inversé sur du papier absorbant pendant
2 à 3 minutes. Sécher délicatement les tubes au buvard pour garantir
l'absorption de l'ensemble du liquide.
13.9 Mesurer la radioactivité en procédant à la numération de chaque tube pendant
1 minute dans un compteur gamma. Les tubes doivent être comptés pendant
au moins 1 minute (voir la section : Limitations de la procédure).
14. COMMENTAIRES SUR LA PROCÉDURE
14.1 Ajouter chaque aliquote de réactif au tiers inférieur du tube de dosage pour
garantir le mélange complet des réactifs.
14.2 Les proportions correctes de solvant doivent être respectées pour obtenir des
bons taux de récupération. Préparer les solutions dans des volumes
suffisamment larges pour minimiser l'erreur de mesure.
14.3 Si un échantillon est supérieur à l'étalon le plus élevé, il doit être dilué avec
l'étalon zéro de la trousse et dosé de nouveau avant l'extraction. Les résultats
doivent être multipliés par le facteur de dilution approprié. Par exemple,
mélanger 500 μL d'échantillon avec 500 μL d'étalon zéro, puis doser 500 μL
de cet échantillon dilué conformément à la notice d'utilisation du produit.
*g = (1118 x 10-8 ) (rayon en cm) (tr/min)2
27
14.4 Aucun écart de dosage n'a été observé pendant la durée moyenne de dosage
de 100 tubes.
14.5 Pour surveiller complètement la précision constante d'un dosage RIA, le
laboratoire peut parfois vérifier d'autres facteurs. DiaSorin suggère un contrôle
régulier des paramètres suivants pour garantir la précision constante de la
trousse.
a. Numérations totales
b. Liaison maximale
Numérations moyennes par minute (CPM) des tubes de l'étalon 0/CPM
moyenne des tubes de numération totale.
c. Liaison non spécifique
CPM moyenne des tubes NSB/CPM moyenne des tubes de numération
totale.
d. Pente de la courbe d'étalonnage
On peut suivre l'inhibition de 50%.
15. CONTRÔLE QUALITÉ
Chaque laboratoire doit inclure au moins deux contrôles (un contrôle au niveau normal
et un au niveau élevé) à chaque dosage pour surveiller la précision de la trousse. Des
contrôles disponibles dans le commerce ou les 2 contrôles de référence fournis avec la
trousse peuvent être utilisés.
Les contrôles doivent être traités comme des échantillons inconnus et dosés en
doublets. Le laboratoire doit tenir à jour des tableaux de contrôle qualité pour suivre la
précision des contrôles. Les limites acceptables de précision doivent être déterminées
par chaque laboratoire pour chaque niveau de contrôle en utilisant des méthodes
statistiques conçues pour dépister les erreurs systématiques et aléatoires. Les
résultats de contrôle doivent être conformes aux critères d'acceptabilité du laboratoire
avant d'être validés en tant que résultats.12,13,14
16. CALCUL DES RÉSULTATS
Il existe de nombreuses méthodes de calcul des résultats des dosages radioimmunologiques.
Chacune est basée sur l'obtention d'une courbe d'étalonnage en
traçant l'ampleur de la liaison par rapport aux concentrations indiquées pour les
étalons. Ce graphe peut être à l'échelle linéaire ou logarithmique. Chacune de ces
méthodes donne essentiellement les mêmes valeurs pour les contrôles et les
échantillons, même si certains dosages peuvent être mieux “adaptés” à une méthode
particulière que d'autres. Le laboratoire de contrôle qualité DiaSorin utilise la méthode
de calcul avec programme d'ajustement de spline cubique (Spline Smoothed curve fit)
% B/B0 par rapport à la concentration logarithmique .
16.1 Calcul du pourcentage B/B0
a. Calculer la CPM moyenne pour chaque étalon, contrôle et échantillon
inconnu.
b. Soustraire la CPM moyenne des tubes NSB de toutes les numérations.
c. Diviser la CPM moyenne corrigée de chaque étalon, contrôle ou
échantillon inconnu par la CPM moyenne corrigée de l'étalon 0 et
multiplier par 100.
CPM moyenne (Étalon ou échantillon inconnu) –
moyenne. CPM (NSB)
moyenne CPM (Étalon 0) – moyenne CPM (NSB)
x 100 = B/B0 (%)
28
16.2 Utiliser le tracé de la courbe d'étalonnage
a. En utilisant du papier semi-logarithmique ou logarithmique à 2 cycles,
tracer le pourcentage B/B0 (%) pour les étalons 1,25 (OH)2D portés en
ordonnée (axe Y) par rapport à la concentration des étalons portée en
abscisse (axe X).
REMARQUE : Des programmes de réduction automatique des données
peuvent également être utilisés pour l'analyse des données. DiaSorin
utilise Multi-Calc (Pharmacia) avec programme d'ajustement LIN-LOG de
spline cubique. D'autres méthodes de réduction des données doivent être
validées avant de les incorporer pour une utilisation régulière.
b. Tracer la droite de meilleur ajustement d'un point à l'autre.
c. Interpoler les niveaux de 1,25-(OH)2D dans les échantillons inconnus en
utilisant la courbe d'étalonnage.
d. Si un échantillon inconnu a été dilué, corriger en fonction du facteur de
dilution approprié.
e. L'intervalle de dosage est compris entre 5,0 pg/mL et 200 pg/mL. Toute
valeur qui est inférieure à l'étalon le plus faible, 5,0 pg/mL, a été
extrapolée et peut être notée comme “inférieure à 5 pg/mL”.
f. Calculer la liaison maximale en divisant la CPM de l'étalon 0 par les
numérations totales moyennes obtenues dans les tubes de numération
totale.
Des données d'échantillon typiques pour RIA 1,25-(OH)2D sont rassemblées dans le
TABLEAU IV et à la FIGURE 1 ; ces informations sont données à titre de référence
seulement et ne doivent pas être utilisées pour le calcul d'une valeur quelconque.
TABLEAU IV
Données d'échantillon RIA 1,25-(OH)2D DiaSorin
Tube
Doublet
CPM
Moyenne
CPM
Corrigé
CPM
Pourcentage
Liaison (B/T)
Pourcentage
(B/B0)
Conc.
(pg/mL)
Numération totale 40.792 40.685
40.578
NSB 1.438 1.439 3,5
1.439
Étalon 0 18.006 18.063 16.624 44,4 100,0
18.119
Étalons
(pg/mL)
1 (5,0) 16.710 16.740 15.302 92,0
16.770
2 (15,0) 14.941 14.929 13.490 81,2
14.916
3 (30,0) 13.087 13.106 11.667 70,2
13.124
4 (75,0) 9.820 9.793 8.354 50,2
9.765
5 (200) 6.412 6.438 5.000 30,0
6.464
Contrôles
Niveau 1: 13.275 13.403 11.964 72,0 27,3
valeurs normales 13.530
Niveau 2: 8.206 8.165 6.727 40,5 119
valeurs élevées: 8.124
29
Courbe d'étalonnage pour l'échantillon RIA 1,25-(OH)2D DiaSorin
FIGURE 1
RÉDUCTION DES DONNÉES
Le laboratoire QC DiaSorin utilise un programme d'ajustement de spline cubique.
17. LIMITATIONS DE LA PROCÉDURE
17.1 Les temps de numération doivent être suffisamment long pour empêcher les
erreurs dues à l'inefficacité du compteur (par exemple, 2000 CPM comporteront
5% d'erreur et 10000 CPM 1% d'erreur).
17.2 Les résultats de dosage doivent être utilisés avec d'autres données cliniques
et de laboratoire pour aider le clinicien à prendre des décisions de traitement
individualisées selon le patient.
17.3 Les caractéristiques de précision de ce dosage n'ont pas été établies chez
l'enfant.
18. VALEURS ESCOMPTÉES
Intervalle de référence pour des donneurs normaux
Il est important que chaque laboratoire établisse son propre intervalle de référence
représentatif de sa population typique. Cependant, les valeurs de 1,25-(OH)2D ont été
obtenues au cours d'un essai clinique qui s'est déroulé pendant l'été et l'automne, et
qui comptait 123 volontaires apparemment en bonne santé provenant de trois villes du
Midwest des États-Unis. Ces 123 donneurs sains, 37 hommes et 86 femmes, étaient
d'origine ethnique variée et âgés de 21 à 68 ans. La valeur moyenne de 1,25-(OH)2D
pour l'échantillon complet (n=123) était de 43,9 pg/mL. L'intervalle de référence de
95% estimé par une méthode non-paramétrique (conformément aux directives CLSI
C28-A215) était compris entre 25,1 et 66,1 pg/mL.
Patients souffrant d'une maladie rénale terminale
Un essai clinique a été mené pour évaluer les taux de 1,25-(OH)2D chez des adultes
diagnostiqués avec une maladie rénale terminale. Un total de 87 volontaires
remplissant ces conditions (49 hommes, 38 femmes, âgés entre 19 et 84 ans) issus de
trois villes du Midwest aux Etats-Unis ont été inclus dans l'étude. Les valeurs de 1,25-
(OH)2D pour cet échantillon (n=87) étaient comprises entre 1,6 et 17,3 pg/mL.
La limite de référence de 95% supérieure estimée l'aide de la procédure nonparamétrique
est de 14,2 pg/mL.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 10 100 1000
pg/mL
% B/Bo
30
19. CRITERES DE QUALITE
19.1 Précision
La précision du dosage a été évalué par DiaSorin en se basant sur les principes de la
directive CLSI (EP5-A).16 Trois niveaux de contrôle contenant du sérum humain avec
des concentrations de 1,25-(OH)2-D choisies dans tout l'intervalle de dosage ont été
analysés sur 25 jours, ce qui représente une période de plus de 60 jours. Plusieurs
techniciens et des numéros de lots multiples ont été inclus pour tous les éléments. Les
résultats combinés ont été évalués par l'analyse de la variance (ANOVA) et sont
rassemblés dans le tableau suivant.
Intra-essai
D'un jour à
l'autre Total
Échantillon N
Moyenne
pg/mL
Ecarttype
%CV
Ecarttype
%CV
Ecarttype
%CV
FAIBLE 25 25,8 1,76 6,8 3,8 14,6 4,0 15,3
MOYENNE 25 41,3 3,16 7,7 4,6 11,1 5,1 12,3
ÉLEVÉ 25 105,2 11,86 11,3 11,8 11,2 14,4 13,7
19.2 PURETÉ : LA PURETÉ DU DOSAGE A ÉTÉ VÉRIFIÉE PAR LE TEST DE
LINÉARITÉ ET DE RÉCUPÉRATION.
Linéarité (parallélisme)
La linéarité de la dilution a été évaluée par DiaSorin conformément aux recommandations
de la directive CLSI EP6-P.17 Trois échantillons de sérum humain ont été
préparés en effectuant des dilutions successives avec l'étalon zéro et des aliquotes
congelés individuellement à –20°C. Chaque échantillon et dilution a été dosé plusieurs
fois à trois dates de dosage différentes. Les valeurs escomptées ont été déterminées
en multipliant les valeurs non-diluées de chaque échantillon par le facteur de dilution.
Les données sont rassemblées ci-dessous et les résultats ont permis de tracer la
courbe de régression linéaire des valeurs escomptées par rapport à la valeur
observée.
Échantillon # Dilution
Valeur Escomptée
(pg/mL) (N=10)
Valeur Observée
Moyenne (pg/mL)
(N=10)
1 PUR 49,6 49,6
1:2 24,8 25,3
1:4 12,4 11,1
1:8 6,2 4,4
2 PUR 50,2 50,2
1:2 25,1 24,2
1:4 12,6 12,2
1:8 6,3 4,6
3 PUR 62,0 62,0
1:2 31 31,9
1:4 15,5 13,4
1:8 7,8 6,2
31
RÉCUPÉRATION
On a évalué le taux de récupération quantitatif de tout l'analyte présent dans les
échantillons cliniques obtenu avec ce dosage en ajoutant des quantités différentes
d'antigène pur fraîchement préparé de 1,25-(OH)2-D aux trois échantillons patients.
Trois concentrations ont été choisies et dosées en doublets pour déterminer le
pourcentage de récupération. La moyenne de récupération (%) obtenue par cette
méthode était de 101%.
Échantillon #
Conc. init.
(pg/mL)
1,0 mL
Quantité de
dopage (pg)
*Escomptée
(pg/mL)
Observée
(pg/mL)
%
Récupération
50,0 77,7 75,6 97
1 30,8 62,5 88,9 87,2 98
75,0 99,8 103 103
50,0 89,2 89,5 100
2 42,8 62,5 100,3 98,9 99
75,0 111,0 118 106
50,0 86,8 83,9 97
3 40,3 62,5 97,9 103 105
75,0 108,8 118 108
*Le calcul de la concentration attendue inclut un facteur de dilution introduit en dopant
la solution.
19.3 Sensibilité analytique
La sensibilité de ce dosage lorsqu'elle est définie comme la quantité la plus faible
différente de zéro à 2 écarts-types en-dessous de la cpm moyenne de l'étalon zéro
(n=20), s'est avérée <2.0 pg/mL.
19.4 Spécificité analytique
Les données de réactivité croisée de l'antisérum utilisé dans cette trousse sont
exprimées comme la concentration de 1,25-(OH)2D3 rapportée à la réaction croisée de
concentration de substance avec inhibition de 50 % de la liaison maximale.
Conc. mesurée à 50% B/Bo % Réactivité croisée
24,25 D3 76 420 pg/mL <0,5
25,26 D3 24 330 pg/mL <0,5
25 D3 >>>1 mg/mL <0,5
19.5 Substances interférentes
Une étude de l'interférence a été faite pour déterminer si des taux élevés de
substances endogènes courantes pouvaient avoir un effet négatif sur les résultats du
dosage. L'évaluation était conforme aux directives CLSI (EP7-P).18 Trois échantillons
de sérum humain contenant des taux faibles, moyens et élevés de 1,25-(OH)2-D3 ont
été dosés après addition de la substance analysée ou addition des contrôles dopés
avec des volumes identiques du véhicule de la substance dosée. Chaque échantillon
a été extrait deux fois ce qui a donné quatre résultats. Les résultats rassemblés
ci-dessous montrent
l'absence d'interférence avec les substances dosées, après l'analyse statistique par
ANOVA (intervalle de confiance de 95%), ou par la valeur moyenne des échantillons
dopés dépassant les intervalles des contrôles avec ± 2 écarts-types.
32
Bilirubine
Échantillon #
Moyenne
du contrôle
(pg/mL)
intervalle ± 2
écarts types
du contrôle
Moyenne de
bilirubine
(pg/mL)
Interférence
ANOVA
Faible 19,9 18,5-21,3 19,5 0,54
Moyen 31,7 27,7-35,7 29,9 0,22
Élevé 79,7 63,5-95,9 83,2 0,45
Cholestérol
Échantillon #
Moyenne
du contrôle
(pg/mL)
intervalle ± 2
écarts types
du contrôle
Moyenne de
cholestérol
(pg/mL)
Interférence
ANOVA
Faible 19,9 18,5-21,3 19,4 0,64
Moyen 31,7 27,7-35,7 29,7 0,15
Élevé 79,7 63,5-95,9 75,2 0,40
Triglycéride
Échantillon #
Moyenne
du contrôle
(pg/mL)
intervalle ± 2
écarts types
du contrôle
Moyenne de
triglycéride
(pg/mL)
Interférence
ANOVA
Faible 14,7 12,9-16,5 15,1 0,88
Moyen 30,4 22,4-38,4 33,4 0,25
Élevé 92,6 69,5-116,9 95,4 0,68
Hémoglobine
Échantillon #
Moyenne
du contrôle
(pg/mL)
intervalle ± 2
écarts types
du contrôle
Moyenne de
l'hémoglobin
e (pg/mL)
Interférence
ANOVA
Faible 21,5 17,5-25,5 20,8 0,53
Moyen 38,6 35,4-41,8 40,0 0,43
Élevé 112,7 101,4-124,0 120,6 0,17
Urée
Échantillon #
Moyenne
du contrôle
(pg/mL)
intervalle ± 2
écarts types
du contrôle
Moyenne de
l'urée
(pg/mL)
Interférence
ANOVA
Faible 25,1 20,9-29,3 26,6 0,39
Moyen 36,2 23,8-48,6 35,9 0,96
Élevé 120,1 97,4-142,8 118,6 0,82
VOIR LA DERNIÈRE PAGE POUR RÉFÉRENCE
33
PROCÉDURE DE DOSAGE
1. Les étalons, contrôles et inconnus sont tous reconstitués avec de l'éthanol
95% et du traceur après l'étape de séchage de la procédure avec la colonne.
2. Distribuer les réactifs conformément au profil :
Tubes/réactifs
Numérations
totales NSB
Étalon
0-5
Contrôles et
échantillons
inconnus
Étalons reconstitués - - 75 μL -
Contrôles et échantillons
inconnus reconstitués - - - 75 μL
Éthanol 95% et traceur ** 75 μL 75 μL - -
Tampon NSB - 300 μL - -
Antisérum 1,25-(OH)2-D - - 300 μL 300 μL
REMARQUE : Les tubes de numération totale et NSB sont obtenus en ajoutant 50 μL
d'éthanol 95% avec 125 μL de traceur et en pipetant 75 μL de ce mélange dans les
tubes de dosage en doublets.
3. Bien mélanger ; incuber pendant 2 heures (+/- 15 minutes) entre 20 et 25°C.
4. Distribuer 500 μL de réactif précipitant GAR dans les puits, à l'exception des
tubes de numération totale.
5. Bien mélanger ; incuber pendant 20 minutes (+/- 5 minutes) entre 20 et 25°C.
6. Centrifuger à 1 800 x g* pendant 20 minutes entre 20 et 25°C.
7. Décanter les surnageants.
8. Procéder à la numération de chaque tube dans un compteur gamma pendant
1 minute.
*g = (1118 x 10-8) (rayon en cm) (tr/min)2
34
1,25-DIHYDROXYVITAMIN D 125I RIA-KIT
1. VERWENDUNGSZWECK
NUR ZUR IN-VITRO-DIAGNOSTIK
Der 1,25-Dihydroxyvitamin D 125I RIA ist ein kompetitiver Radioimmunoassay zur
quantitativen Bestimmung von 1,25-Dihydroxyvitamin D (1,25-(OH)2-D) in Humanserum
oder EDTA-Plasma für die Beurteilung des mit Nierenerkranungen assoziierten
1,25-(OH)2-D-Mangels. Die Testergebnisse sollten in Verbindung mit anderen klinischen
und labordiagnostischen Daten verwendet werden, um den Arzt dabei zu unterstützen, bei
Erwachsenenpopulationen individuelle Patientenmanagement-Entscheidungen zu treffen.
2. ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG
Vitamin D entsteht aus zwei Quellen: Es wird exogen durch die Nahrung zugeführt und
endogen aufgebaut (durch UV-Licht-Exposition regulierte Biosynthese). Zur exogenen
Quelle gehören Nahrungsmit mit einem natürlich niedrigen Vitamin D2 -Gehalt
(z. B. Milch, Butter, mit Vitamin D2 angereichertes Getreide), Nahrungsergänzungsmit
in Form von frei verkäuflichen Vitaminen und therapeutische Rezepturen von D2 -
Vitaminen.1 Vitamin D ist nicht inhärent aktiv, wenn es über die Nahrung oder über
photochemische Prozesse in den Kreislauf gelangt. Es wird erst nach mehreren
komplexen Stoffwechselschritten biologisch aktiv.2
Es ist bekannt, dass die metabolische Aktivierung von Vitamin D ein komplizierter,
kontrollierter Prozess ist, der durch verschiedene Faktoren beeinflusst wird, wie z. B.
durch Nahrungscalcium und -phosphor, den Grad des Vitamin-D-Mangels, genetische
Mängel, Parathormon-Konzentrationen, die Einwirkung von UV-Licht und den Grad der
Nierenfunktion.3 Die Biosynthese der dihydroxylierten Formen von Vitamin D3 beginnt
damit, dass in der Haut unter Einwirkung von ultraviolettem Sonnenlicht aus
7-Dehydrocholesterin Vitamin D3 gebildet wird. Sobald Vitamin D3 in den Kreislauf
eintritt, wird es schnell von der Leber aufgenommen und dort zu 25-Hydroxyvitamin D3
(25-OH-D3) metabolisiert. In der Leber wird auch Vitamin D2 in 25-Hydroxyvitamin D2
(25-OH-D2) hydroxyliert.2,4
Nach der Hydroxylierung in der Leber wird 25-OH-D mit dem Vitamin-D-bindenden
Protein zur Niere transportiert, wo es weiter hydroxyliert wird. Durch Hinzufügen einer
Hydoxylgruppe an Position 1 entsteht 1,25-Dihydroxyvitamin D (1,25-(OH)2-D).
1,25-Dihydroxyvitamin D ist der stärkste, natürlich vorkommende Vitamin-D-Metabolit,
der bisher entdeckt wurde. Seine Produktion wird durch die Serumkonzentrationen von
Calcium, Phosphor und Parathormon streng kontrolliert. Bei Calciumstress ist
1,25-(OH)2-D der wichtigste Vitamin-D-Metabolit, der in der Niere gebildet wird.5,6
Dies ist auf seine wichtige Rolle bei der aktiven Absorption von Calcium und Phosphor
sowie ihrem normalen Stoffwechsel zurückzuführen. Die Messung von 1,25-(OH)2-D
hat sich daher als effizientes Mit in der Erforschung von Erkrankungen herausgeslt,
die den normalen Phosphor- und Calciumstoffwechsel beeinträchtigen.7,8,9
3. TESTPRINZIP
Der DiaSorin 1,25-(OH)2-D Test wird in zwei Schritten durchgeführt. Zunächst werden
Vitamin-D-Metaboliten aus Serum oder EDTA-Plasma mit Hilfe von C18OH-Kartuschen
extrahiert und anschließend gereinigt.10 Nach der Extraktion wird die vorbehandelte Probe
in einem kompetitiven Radioimmunoassay untersucht. Der Radioimmunoassay basiert
auf einem polyklonalen Antikörper, der sowohl für 1,25-(OH)2 D2 als auch 1,25-(OH)2D3
spezifisch ist. Die Probe, der Antikörper und der Tracer werden 2 Stunden lang bei
20-25°C inkubiert. Die Phasentrennung erfolgt nach 20-minütiger Inkubation bei 20-25°C
mit einem zweiten präzipitierenden Antikörperkomplex. Nach der Zentrifugation und
Dekantierung wird die gebundene Fraktion im Pellet in einem Gammazähler
gemessen.
35
Die Werte werden direkt aus einer Eichkurve bekannter Konzentrationen berechnet.
Die Endkonzentration des 1,25-(OH)2D in Serum- und EDTA-Plasmaproben wird in
pg/mL ausgedrückt.
4. KITREAGENZIEN
1,25-(OH)2D NSB-PUFFER 1 Fläschchen / 3 mL
1,25-(OH)2D NULLKALIBRATOR 1 Fläschchen / 20 mL
1,25-(OH)2D3 KALIBRATOR 1-5 5 Fläschchen / 3 mL
1,25-(OH)2D ANTISERUM 1 Flasche / 35 mL
125 I 1,25-(OH)2D3 1 Fläschchen / 10 mL
1,25-(OH)2D3 VORBEHANDLUNGSLÖSUNG 1 Flasche / 50 mL
1,25-(OH)2D PRÄZIPITIERENDER ZIEGEANTI-
KANINCHEN-KOMPLEX 2 Fläschchen / 35 mL
1,25-(OH)2D KONTROLLSERUM 2 Fläschchen / 3 mL
95%iges ETHANOL 1 Fläschchen / 7 mL
Anzahl der Tests 100
LAGERUNG: Der Kit sollte bei 2-8°C aufbewahrt werden. Nach dem Öffnen jedes
Reagenz bei 2-8°C nicht länger als bis zu dem auf dem Etikett angegebenen
Verfallsdatum lagern. Die Reagenzien dürfen nach dem Verfallsdatum nicht verwendet
werden. Das Verfallsdatum des Kits ist auf dem äußeren Etikett angebracht und
entspricht dem Verfallsdatum des Tracers.
Bei der Rekonstitution den Inhalt der Fläschchen vorsichtig mischen, um
Schaumbildung zu vermeiden. Alle rekonstituierten Reagenzien sofort nach Gebrauch
bei –15°C oder darunter lagern. Reagenzien aus verschiedenen Chargen dürfen nicht
vermischt werden.
4.1 1,25-(OH)2D NSB-Puffer: gebrauchsfertiges Reagenz
Kaliumphosphatgelatinepuffer mit ProClin 300 (< 0,2 %).
4.2 1,25-(OH)2D Nullkalibrator: gebrauchsfertiges Reagenz
Phosphatpuffer mit Rinderserumproteinen und ProClin 300 (< 0,2 %).
4.3 1,25-(OH)2D3 Kalibratoren (1-5): lyophilisiertes Reagenz
Fünf lyophilisierte (1,25-(OH)2D3) Kalibratoren in Konzentrationen zwischen 5 und
200 pg/mL mit Humanserum und ProClin 300 (<0,2%). Jeden Kalibrator mit 3,0 mL
des Nullkalibrators rekonstituieren. Die genauen Konzentrationen sind auf den
Fläschchenetiketten angegeben. Die Kalibratoren des Kits werden mits UVBestimmung
kalibriert. Die Kitkalibratoren sind mit Patientenproben austauschbar,
wenn sie mit Reagenzien verwendet werden und dieser diagnostische In-vitro-Test wie
empfohlen durchgeführt wird.
4.4 1,25-(OH)2D Antiserum: gebrauchsfertiges Reagenz
Kaninchen-anti-1,25-(OH)2D-Serum, verdünnt in Phophatgelatinepuffer mit ProClin 300
(<0,2%).
4.5 125I 1,25-(OH)2D3 gebrauchsfertiges Reagenz
Radioiodiertes 1,25-(OH)2D3-Analogon, verdünnt in einem Ethylenglykolphosphatpuffer.
4.6 1,25-(OH)2D3 Vorbehandlungslösung: gebrauchsfertiges Reagenz
Kaliumphosphatpuffer.
4.7 1,25-(OH)2D Kontrollen: Konzentration 1 (normal), Konzentration 2 (hoch):
gebrauchsfertiges Reagenz
Vorbehandelter Humanserum-Pool mit ProClin 300 (<0,2%), versetzt mit den
entsprechenden Mengen 1,25-(OH)2D, um Kontrollkonzentrationen innerhalb der
angegebenen Bereiche zu erhalten. Kontrolle 1 liegt innerhalb des Normalbereichs,
36
Kontrolle 2 innerhalb eines erhöhten Bereichs. Der Konzentrationsbereich jeder
Kontrolle ist auf dem Analysenzertifikat angegeben; er gibt die Grenzen an, die von
DiaSorin für Kontrollwerte festgelegt wurden, die in zuverlässigen Testdurchgängen
erhalten werden können.
4.8 Präzipitierender Ziege-anti-Kaninchen (GAR)-Komplex: lyophilisiertes Reagenz
Normales Kaninchenserum, vor-präzipitiert mit Ziege-anti-Kaninchenserum und Polyethylenglykol
(PEG), wird in einem BSA-Boratpuffer mit 0,1% Natriumazid und anderen
zugefügten (lyophilisierten) Konservierungsmitn verdünnt. Das Fläschchen mit 35 ml
destilliertem oder entionisiertem Wasser rekonstituieren, bis die Suspension homogen
aussieht, dann bei Raumtemperatur mindestens 30 Minuten lang stehen lassen und
gelegentlich mischen.
4.9 95 % Ethanol: gebrauchsfertiges Reagenz
95% Ethanol und 5% Wasser.
HINWEIS: Für dieses Verfahren werden ebenfalls C18OH-Kartuschen benötigt.
Diese Kartuschen müssen gesondert unter der DiaSorin Kat. Nr. 65101E beslt
werden.
5. WARNHINWEISE UND VORSICHTSMASSNAHMEN
NUR ZUR IN-VITRO-DIAGNOSTIK
Nicht für internen oder externen Gebrauch bei Menschen oder Tieren.
VORSICHT: Dieses Produkt darf nur von Ärzten, klinischen Laboren, Krankenhäusern
oder Forschungseinrichtungen entgegengenommen, erworben, besessen und
verwendet werden. Die Tests dürfen nur von entsprechend qualifizierten und
geschulten Labormitarbeitern durchgeführt werden.
REAGENZIEN MIT MATERIAL HUMANEN URSPRUNGS
Dieses Produkt ist als potenzieller Infektionserreger zu behandeln.
Alle in der Herslung dieses Produktes verwendeten Serum- bzw. Plasmaspendeeinheiten
wurden nach einer FDA-genehmigten Methode getestet und für nicht reaktiv
auf Hepatitis-B-Oberflächenantigen (HBsAg), Hepatitis-C-Antikörper (HCV) und
Antikörper für HIV-1/2 befunden. Obwohl diese Methode äußerst genau ist, bietet sie
keine Gewähr dafür, dass alle infizierten Einheiten identifiziert werden können. Dieses
Produkt kann auch Material humanen Ursprungs enthalten, für welches es noch kein
genehmigtes Testverfahren gibt. Da keine der zur Zeit bekannten Testmethoden
absolute Gewähr für die Abwesenheit des Hepatits-B-Virus (HBV), Hepatitis-C-Virus
(HCV), des Retrovirus (HIV) oder anderer Infektionserreger bieten kann, sind alle
Produkte mit Komponenten humanen Ursprungs unter Einhaltung guter Laborpraktiken
mit den geeigneten Vorsichtsmaßnahmen zu handhaben, wie im Handbuch “Biosafety
in Microbiological and Biomedical Laboratories” (Biosicherheit in mikrobiologischen und
biomedizinischen Laboren) (4. Auflage, Mai 1999, oder aktuelle Auflage) der Centers
for Disease Control and Prevention und der National Institutes of Health (amerikanische
Krankheitsforschungszentren / Staatliche Gesundheitsinstitute) beschrieben.
REAGENZIEN MIT NATRIUMAZID
VORSICHT: Einige Reagenzien in diesem Kit enthalten Natriumazid, das
gegebenenfalls mit Blei- oder Kupferleitungen reagieren und höchst explosive
Metallazide bilden kann. Zur Entsorgung mit reichlichst Wasser nachspülen, um
Azidaufbau zu vermeiden. Weitere Informationen finden Sie im Abschnitt
“Decontamination of Laboratory Sink Drains to Remove Azide Salts”
(Dekontaminierung von Abflüssen in Laborspülbecken zur Entsorgung von Azidsalzen)
des Handbuches “Safety Management” (Sicher-heitsmaßnahmen), Nr. CDC-22,
herausgegeben von den Centers for Disease Control and Prevention (USKrankheitsforschungszentren),
Atlanta, Bundesstaat Georgia, 1976.
37
Europäische Gemeinschaften: Gefahrenbezeichnungen für gefährliche Stoffe
(Richtlinie 1999/45/EG)
R 20/21/22 - Gesundheitsschädlich beim Einatmen, Verschlucken und Berührung mit
der Haut.
R 32 - Entwickelt bei Berührung mit Säure sehr giftige Gase.
S28 - Bei Berührung mit der Haut sofort mit viel Wasser abwaschen.
ETHANOL ENTHALTENDE REAGENZIEN
Europäische Gemeinschaften: Gefahrenbezeichnungen für gefährliche Stoffe
(Richtlinie 1999/45/EG)
R11 - Leichtzendzündlich
S16 - Von Zündquellen fernhalten - Nicht rauchen
S43 - Zum Löschen Trockenlöschmit oder Kohlendioxid verwenden
REAGENZIEN MIT IOD-125
Dieses Kit enthält radioaktives Material mit nicht mehr als 5,5 μCi (204 kBq) Iod-125.
Bei der Lagerung, Handhabung und Entsorgung dieses Materials sind entsprechende
Vorsichtsmaßnahmen und gute Laborpraktiken einzuhalten.
Für Ärzte bzw. Institutionen, welche im Rahmen einer Generallizenz Radioisotope
erhalten:
Entgegennahme, Erwerb, Besitz und Verwendung dieses radioaktiven Materials sind
nur Ärzten, klinischen Laboren oder Krankenhäusern und nur für klinische In-vitro-
Tests oder In-vitro-Labortests gestattet, bei denen kein interner oder externer Kontakt
des Materials oder seiner Strahlung mit Menschen oder Tieren stattfindet.
Entgegennahme, Erwerb, Besitz, Verwendung und Weitergabe des Materials
unterliegen den Vorschriften und der Generallizenz der US Nuclear Regulatory
Commission (US-amerikanische Strahlenschutzbehörde) bzw. des Staates, mit dem
diese Behörde ein Abkommen zur Ausübung ihrer Überwachungsfunktion
abgeschlossen hat.
1. Die Lagerung des radioaktiven Materials ist auf einen speziell dafür bestimmten
Bereich zu beschränken.
2. Der Zugang zu radioaktivem Material ist nur befugten Personen zu gestatten.
3. Radioaktives Material nicht mit dem Mund pipettieren.
4. Im vorgesehenen radioaktiven Arbeitsbereich nicht essen oder trinken.
5. Verschüttetes Material aufwischen und Bereich anschließend mit alkalischem
Reinigungsmit oder radiologischer Dekontaminationslösung waschen. Alle
benutzten Glasbehälter vor dem Waschen mit anderen Laborbehältern aus Glas
gründlichst mit Wasser spülen.
Für Ärzte oder Einrichtungen, die im Rahmen einer Sondergenehmigung Radioisotope
erhalten:
Entgegennahme, Gebrauch, Weitergabe und Entsorgung radioaktiven Materials
unterliegen den Vorschriften und Bedingungen der jeweiligen Sondergenehmigung.
WARNHINWEIS: Dieses Produkt enthält eine Chemikalie, die nach Angaben des USBundesstaates
Kalifornien krebserregend ist.
ACHTUNG: Die auf der Packungsbeilage angegebene Radioaktivität kann von der auf
dem Etikett des Kartons und des Tracer-Fläschchens angegebenen etwas abweichen.
Sowohl das Etikett des Kartons als auch das Etikett des Tracer-Fläschchens geben
den tatsächlichen Wert der Radioaktivität am Kalibrationsdatum an, während die
Packungsbeilage die theoretische Radioaktivität darslt.
38
6. ANZEICHEN FÜR MÖGLICHEN VERFALL DER KITREAGENZIEN
6.1 Das Vorhandensein abnormer Partikel in einem der Reagenzien.
6.2 Eine Veränderung der Steigung oder des Verlaufs der Eichkurve im Vergleich
zu den gewöhnlich erzielten Ergebnissen.
6.3 Eine Abnahme der maximalen Bindung
6.4 Eine hohe nichtspezifische Bindung
7. ENTNAHME UND VORBEREITUNG VON SERUM UND PLASMA
Beim 1,25-Dihydroxyvitamin D-Kit werden für die Extraktion 500 μL Serum oder EDTAPlasma
benötigt; 1,5 mL ermöglichen Wiederholungsanalysen und slen zudem ein
adäquates Pipettiervolumen dar.
In diesem Kit kann humanes Serum oder Plasma verwendet werden. Bei diesem Test
kann das Antikoagulans EDTA verwendet werden. Nüchternproben werden empfohlen,
sie sind jedoch nicht erforderlich. Blut unter aseptischen Bedingungen durch
Venenpunktion in ein 5- oder 10-mL-Glasröhrchen aufnehmen. Bei Serumproben Blut bei
Raumtemperatur (15-25°C) gerinnen lassen. Zur Gewinnung von hämolysefreiem Serum
Blutproben 15 Minuten lang mit ca. 760 x g* zentrifugieren. Zur Aufrechterhaltung der
Probenreinheit sind weder Zusatzstoffe noch Konservierungsmit erforderlich. Alle mit
der Probe in Kontakt gekommenen Kunststoffbehälter, Glasbehälter oder anderen
Materialien sind von jeder Verunreinigung freizuhalten.
Serum- oder Plasmaproben bei -15°C oder darunter lagern. Die Proben dürfen nicht
wiederholt eingefroren und wieder aufgetaut werden. In einer von DiaSorin durchgeführten
Studie konnte jedoch gezeigt werden, dass sich die Werte nach dreimaligem
Einfrieren und Auftauen der Proben nicht signifikant geändert haben. Die Proben
wurden bei DiaSorin bis zu sechs Monate lang bei -15°C oder darunter gelagert, ohne
dass sich die Ergebnisse signifikant geändert haben.
8. ZUSÄTZLICH BENÖTIGTE GERÄTE UND MATERIALIEN
8.1 C18OH-Kartuschen (24 Kartuschen), gesondert zu beslen unter DiaSorin
Kat. Nr. 65101E
8.2 Einweg-Borosilikatglasröhrchen, 12 x 75 mm und 13 x 100 mm
8.3 Röhrchenständer
8.4 Parafilm oder gleichwertige Abdeckung für Teströhrchen
8.5 Schaumstoffständer zum Dekantieren oder Gleichwertiges
8.6 Zentrifuge für 12 x 75 mm Röhrchen (1800 x g*)
8.7 Gammazähler zur Messung von 125I.
8.8 Vibrationsmischer (Vortex)
8.9 Pipettiergeräte:
a. Mikropipetten zur Abgabe von 75 μL, 300 μL und 500 μL
b. Multipipetten zur Abgabe von 50 μL, 300 μL und 500 μL
c. Messpipetten zur Rekonstitution von Kalibratoren, 3,0 mL
8.10 Destilliertes oder entionisiertes Wasser
* g = (1118 x 10-8 ) (Radius in cm) (U/min)2
39
8.11 Organische Lösungsmit:
Die folgenden Lösungsmit werden für die Probenvorbereitung und -
extraktion benötigt.
Nur HPLC-Lösungsmit verwenden.
Die organischen Lösungsmit dürfen nicht mit säuregewaschenen
Glasbehältern oder anderen säurehaltigen Mitn in Kontakt kommen.
a. Acetonitril
b. Methanol
c. Hexan (WICHTIG: Der Anteil vonn-Hexan muss mehr als 95 % betragen.)
d. Methlyenchlorid (darf nicht Alkohol als Konservierungsmit enthalten)
e. Isopropanol (2-Propanol)
8.12 Empfohlenes Gerät für die C18OH-Kartuschen:
a. Vac Elut Probenverarbeitungsstation. Verarbeitet 24 Säulen pro Serie.
Erhältlich bei Analytichem International oder DiaSorin. Beslung bei
DiaSorin unter der DiaSorin Kat. Nr. 11610.
8.13 Zum Trocknen der Proben benötigte Materialien:
a. Stickstoffgas
b. Mehrfach trocknen mit 37°C (±2°C) warmem Heizblock oder Wasserbad:
N-EVAP oder MULTI-VAP, erhältlich bei Organomation Associates
(Berlin, MA), oder Reacti-Vap II und Reacti-Therm III, erhältlich bei Pierce
Chemical Company (Rockford, IL).
9. VORBEREITUNG ORGANISCHER LÖSUNGSMIT ZUR
SÄULENEXTRAKTION
HINWEIS: Die Mischungen der organischen Lösungsmit sollten vor Beginn
des vorläufigen Extraktionsverfahrens vorbereitet werden.
VORSICHTSMASSNAHMEN:
Lösungsmitmischungen wie in TABELLE I beschrieben vorbereiten; DiaSorin
empfiehlt die Vorbereitung von 500 mL. Größere oder kleinere Volumen können
vorbereitet werden, solange die Verhältnisse beibehalten werden. Die Volumen sollten
jedoch groß genug sein, um Messfehler zu minimieren. Die besten Ergebnisse werden
erzielt, wenn jedes Lösungsmit unabhängig gemessen wird.
VORSICHTSMASSNAHMEN:
Destilliertes oder entionisiertes Wasser verwenden.
TABELLE I
Lösungsmitvorbereitung
Lösungsmit
mischung Materialien 1 L 500 mL
Methanol 700 mL 350 mL
70:30 Wasser 300 mL 150 mL
Hexan 900 mL 450 mL
90:10 Methylenchlorid 100 mL 50 mL
Hexan 990 mL 495 mL
99:1 IPA 10 mL 5 mL
Hexan 920 mL 460 mL
92:8 IPA 80 mL 40 mL
40
10. VORLÄUFIGES EXTRAKTIONSVERFAHREN
10.1 Jeden lyophilisierten Kalibrator mit 3,0 mL Nullkalibrator rekonstituieren. Die
Kalibratoren gut mischen und 15-20 Minuten lang stehen lassen, um eine
vollständige Rekonstitution zu gewährleisten. Gefrorene Reagenzien
vollständig auftauen. Alle Reagenzien auf Raumtemperatur bringen. Die
Reagenzien dürfen nicht auf mehr als 25°C erwärmt werden. Alle Reagenzien
vor Gebrauch gut mischen.
10.2 500 μL jedes Kalibrators (0-5), jeder Kontrolle und jeder Patientenprobe in
12 x 75 mm Borosilikatglasröhrchen pipettieren.
10.3 Zu jeder Probe 500 μL Acetonitril geben; intermittierend mindestens 3-mal in
einem Zeitraum von 10 Minuten auf dem Vortex mischen.
10.4 Die Röhrchen mit 760 x g* 10 Minuten lang bei 20-25°C zentrifugieren.
10.5 Die Probenüberstände in 12 x 75 mm oder 13 x 100 mm Teströhrchen
dekantieren; die Pellets verwerfen.
10.6 Zu jedem Röhrchen 500 μL Vorbehandlungslösung geben und auf dem Vortex
mischen.
Hinweis: Dieser Kit ist für bis zu 48 Extraktionen einschließlich Kalibratoren
und Kontrollen sowie 40 unbekannten Proben ausgelegt. Das bedeutet, dass
24 Proben sofort mit dem VacElut und die übrigen 24 Proben anschließend
extrahiert werden können. Die Säulenextraktionen sollten nach der Zugabe
der Vorbehandlungslösung so bald wie möglich durchgeführt werden. Nach
der Säulenextraktion können die Proben jedoch 96 Stunden lang bei -15°C
oder darunter aufbewahrt werden.
10.7 Die Proben können jetzt auf die C18OH-Kartuschen appliziert werden.
11. SÄULENVERFAHREN
11.1 Erklärungen zum VAC ELUT finden Sie in der VAC ELUT Gebrauchsanweisung.
Die Station wie angegeben aufbauen.
11.2 Ein 13 x 100 mm Borosilikatglasröhrchen für jeden Kalibrator (0-5), jede
Kontrolle und jede unbekannte Probe beschriften. Diese Röhrchen in den VAC
ELUT slen. Der VAC ELUT muss sich in der Position “WASTE” befinden,
und die Röhrchen muss so positioniert sein, dass sie die gewünschten Eluate
auffangen. Die C18OH-Kartusche auf die VAC ELUT Abdeckung legen.
11.3 Die Lösungsmitmischungen wie in TABELLE II beschrieben zur Kartusche
geben.
WICHTIG:
Vakuumeinsatz:
Nach jeder Lösungsmitzugabe das Vakuum einschalten und die
Lösungsmitmischung vollständig durch die Kartusche fließen lassen, bevor mit
dem nächsten Lösungsmit fortgefahren wird. Das Vakuum bei den empfohlenen
Schritten (siehe TABELLE II) ein- und wieder ausschalten (das Vakuum kann
auch zwischen jeder Lösungsmitzugabe ausgeschaltet werden). Das Vakuum
sollte auf 10 Zoll (254 mmHg) oder niedriger eingeslt werden. Jede Lösungsmitmischung
bis zum letzten Schritt durch den Auslass “WASTE” und in
geeignete Abfallbehälter eluieren.
* g = (1118 x 10-8 ) (Radius in cm) (U/min)2
41
Probenapplikation:
Die Proben können entweder direkt auf die Kartusche dekantiert oder mit einer
Pipette appliziert werden.
Die Kartuschen dürfen zwischen den Applikationen nicht länger als 5 Minuten an
der Luft trocknen.
Vorbehandlung der C18OH-Kartusche:
Vor dem ersten Gebrauch sollten die C18OH-Kartuschen mit 5 mL 90:10 (Hexan:
Methlyenchlorid), 5 mL IPA und 5 mL Methanol gewaschen werden. Die 90:10
(Hexan: Methylenchlorid)-Lösungsmitmischung kann vorbereitet werden, indem
900 mL Hexan und 100 mL Methylenchlorid abgemessen werden. Die neuen,
ungebrauchten Kartuschen auf den VAC ELUT legen, die Position "WASTE"
einslen, zuerst 5 mL 90:10 (Hexan: Methylenchlorid) und dann 5 mL IPA zu
jeder Säule und schließlich 5 mL Methanol zugeben. Jede Lösungsmitmischung
muss vollständig durch die Kartuschen fließen, bevor mit der nächsten
Mischung fortgefahren wird. Nach dieser Vorbereitung ist es nicht notwendig,
diesen Schritt zu wiederholen, da die Kartuschen während des Extraktionsverfahrens
aufbereitet werden.
HINWEIS: Wenn weitere Proben extrahiert werden sollen (mehr als 24), die
Kartuschen nach dem in TABELLE II skizzierten Verfahren aufbereiten. Die
Kartuschen können bis zu 30-mal wiederverwendet werden.
HINWEIS: Das Material der C18OH-Kartusche wird mit einer porösen
Glasfaserfritte in Position gehalten. Kartuschen mit dislozierten oder fehlenden
Fritten verwerfen, da das C18OH-Material verloren gehen kann.
42
TABELLE II
Extraktionsbeschreibung und -
analyse
Extraktionsschritte Handhabung
Elutionsmit
1. 1 mL Methanol zugeben,
Vakuum einschalten.
Säulenvorbereitung/
Aufbereitung Entfernt: Störende
Substanzen vom vorherigen
Gebrauch (Schritt 1) 2. Vakuum ausschalten.
Verwerfen
“WASTE”
Probenapplikation
3. Alle Proben applizieren,
Vakuum einschalten. aus
vorläufigem Extraktionsverfahren
(Schritt 10).
Verwerfen
“WASTE”
Reinigung/Entfernung von
Vitamin-D-Metaboliten
4. 5 mL 70:30 Methanol/Wasser
(entionisiert oder destilliert)
zugeben.
Entfernt: Störende polare Lipide,
Salze und Pigmente (Schritt 4)
5. 5 mL 90:10
Hexan/Methylenchlorid
zugeben.
25(OH)D (Schritt 5) 6. 5 mL 99:1 Hexan/Isopropanol
zugeben.
Verbleibendes 25(OH)D und
24,25(OH)2 D/25,26(OH)2 D
(Schritt 6)
7. Das Vakuum ausschalten.
Verwerfen
“WASTE”
Gewinnung von 1,25-(OH)2 D WICHTIG!
Elution von gereinigtem 1,25-(OH)2 D
(Schritt 9)
8. Den Vac Elut auf “Collect:”
schalten.
9. 3 mL 92:8 Hexan/Isopropanol
zugeben, das Vakuum
einschalten.
10. Das Vakuum ausschalten.
“COLLECT”
12. TROCKNEN UND REKONSTITUIEREN VON ELUATEN
12.1 Die Probenröhrchen mit den Eluaten zum Trocknen in einen Heizblock oder in
ein Wasserbad bei 37°C (±2°C) slen.
12.2 Die Eluate unter einer Abzugshaube mit 2-4 psi Stickstoffgas (Trocknungszeit
20-30 Minuten) trocknen.
12.3 Die Röhrchen sofort entfernen, nachdem das Eluat getrocknet ist.
12.4 Jedes der getrockneten Extrakte mit 50 μL 95%igem Ethanol rekonstituieren;
vorsichtig bei niedriger bis mittlerer Geschwindigkeit auf dem Vortex
mischen. 125 μL des Tracers in die Röhrchen geben, die 50 μL 95%iges
Ethanol enthalten, erneut vorsichtig auf dem Vortex bei niedriger bis mittlerer
Geschwindigkeit mischen. HINWEIS: Die Vortexschritte sind für die richtige
Rekonstitution der Probe und für eine gute Präzision äußerst wichtig.
VORSICHT: Den Vortex im unteren Teil des Röhrchens halten, um einen
Verlust des Probenvolumens zu vermeiden und ein ausreichendes Pipettiervolumen
für den Assay sicherzuslen. Ein zusätzliches Röhrchen für die
Totalaktivität und eines für NSB beschriften. Zu beiden Röhrchen 50 μL
95%iges Ethanol und 125 μL Tracer zugeben. Diese werden zur Anfertigung
der Duplikate für TA- (Totalaktivität) und NSB-Röhrchen verwendet.
43
12.5 Den Assay sofort nach der Rekonstitution der Proben durchführen. Bei
größeren Assays werden die besten Ergebnisse erzielt, wenn 12-15 Proben
gleichzeitig rekonstituiert und dann in den Assay pipettiert werden, bevor die
nächsten 12-15 Proben rekonstituiert werden.
13. TESTVERFAHREN
13.1 Beschriftete 12 x 75 mm Einweg-Borosilikatglasröhrchen in doppelter Ausführung
für jeden Kalibrator (0-5), jede Kontrolle und jede Probe gemäß
Testschema vorbereiten. Vorsichtig 75 μL der rekonstituierten Kalibrator-,
Kontrollen- und Probenextrakte in die doppelten Teströhrchen geben.
VORSICHT: Bei diesem Schritt muss mit Vorsicht vorgegangen werden, da
der Überschuss in jedem Röhrchen nur 25 μL beträgt.
13.2 Siehe Schritt Nr. 4, “Trocknen und Rekonstituieren von Eluaten”. 75 μL aus
dem TA-Röhrchen (Totalaktivität) in die doppelten Teströhrchen geben.
Diesen Schritt für die NSB-Teströhrchen (Duplikate) wiederholen.
13.3 300 μL NSB-Puffer in die NSB-Röhrchen geben.
13.4 300 μL des primären Antikörpers in alle Röhrchen außer den Totalaktivitätsund
NSB-Röhrchen geben.
13.5 Gut mischen; 2 Stunden lang (±15 Minuten) bei 20-25°C inkubieren.
HINWEIS: Den präzipitierenden Ziege-anti-Kaninchen-Komplex mit 35 mL
destilliertem oder entionisiertem Wasser rekonstituieren und gut mischen, bis
die Suspension homogen aussieht, dann bei Raumtemperatur mindestens
30 Minuten lang stehen lassen und gelegentlich vor und während des
Gebrauchs mischen.
13.6 500 μL des gut gemischten Ziege-anti-Kaninchen-Komplexes in alle Röhrchen
außer den Totalaktivität-Röhrchen geben. 20 Minuten lang (±5 Minuten) bei
20-25°C inkubieren.
13.7 Mit Ausnahme der Totalaktivität-Röhrchen alle Röhrchen 20 Minuten lang bei
20-25°C mit 1800 x g* zentrifugieren.
13.8 Die Überstände außer bei den Totalaktivität-Röhrchen vorsichtig mit Hilfe
eines Schaumstoffständers o.ä. dekantieren. Dazu den Ständer über einem
geeigneten Abfallbehälter umdrehen. Den umgedrehten Ständer für
2-3 Minuten auf Saugpapier slen. Die Röhrchen vorsichtig ausschlagen, um
zurück-gebliebene Flüssigkeit zu entfernen.
13.9 Zur Messung der Radioaktivität alle Röhrchen in einem Gammazähler
1 Minute messen. Die Röhrchen sollten mindestens 1 Minute lang gemessen
werden (siehe Abschnitt "Grenzen des Verfahrens").
14. ANMERKUNGEN ZUM VERFAHREN
14.1 Jedes Aliquot des Reagenz in das untere Drit des Teströhrchens geben,
damit sich die Reagenzien vollständig vermischen.
14.2 Für eine gute Wiederfindung sind die richtigen Lösungsmitverhältnisse von
entscheidender Bedeutung. Lösungen vorbereiten, deren Volumen groß genug
sind, um Messfehler zu minimieren.
14.3 Wenn die Werte einer Probe größer sind als die größten Kalibratorwerte, ist
die Probe vor der Extraktion mit Nullkalibrator zu verdünnen und neu zu
testen. Die Ergebnisse müssen mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor
multipliziert werden. Mischen Sie beispielsweise 500 μL Probe mit 500 μL
Nullkalibrator und untersuchen Sie dann 500 μL dieser Probenmischung
gemäß Packungsbeilage.
* g = (1118 x 10-8 ) (Radius in cm) (U/min)2
44
14.4 In der Zeit, die durchschnittlich für einen Assay mit 100 Röhrchen benötigt
wird, wurde kein Assay-Drift beobachtet.
14.5 Für eine komplette Laborkontrolle des beständigen Verhaltens eines RIA sind
zusätzliche Faktoren zu berücksichtigen. DiaSorin empfiehlt, die folgenden
Parameter regelmäßig zu überprüfen, um sicherzuslen, dass die Leistung
des Kits konsistent ist.
a. Totalaktivität
b. Maximale Bindung
Durchschnittliche Impulse pro Minute (I/M) der Nullkalibrator-Röhrchen /
Durchschnittliche I/M der Totalaktivität-Röhrchen
c. Nichtspezifische Bindung
Durchschnittliche I/M des NSB-Röhrchens / Durchschnittliche I/M der
Totalaktivität-Röhrchen
d. Steigung der Eichkurve
Die 50%ige Suppression kann überwacht werden.
15. QUALITÄTSKONTROLLE
Jedes Labor sollte in jedem Assay mindestens zwei Kontrollen (eine im Normalbereich
und eine im erhöhten Bereich) einsetzen, um die Leistung des Kits zu überwachen.
Es können handelsübliche Kontrollen oder die beiden Referenzkontrollen verwendet
werden, die im Kit enthalten sind.
Die Kontrollen sollten als unbekannte Proben behandelt und doppelt untersucht
werden. Um die Leistung der Kontrollen zu überwachen, sollten vom Labor Qualitätskontrolltabellen
geführt werden. Jedes Labor sollte mit Hilfe von statistischen
Methoden, mit denen sowohl systematische als auch zufällige Fehler erkannt werden
können, für jede Kontrollkonzentration akzeptable Leistungsgrenzen festlegen. Die
Kontrol-lergebnisse müssen den Akzeptabilitätskriterien des Labors entsprechen,
bevor die Testergebnisse des Patienten mitgeteilt werden können.12,13,14
16. ERGEBNISBERECHNUNG
Es gibt viele Möglichkeiten, die Ergebnisse von Radioimmunoassays zu berechnen.
Bei jeder Methode wird eine Eichkurve angelegt, indem die prozentualen Bindungen
gegen die angegebenen Konzentrationen der Kalibratoren aufgetragen werden. Die
Kurve kann entweder eine lineare oder eine logarithmische Skala haben. Jede dieser
Methoden führt im Wesentlichen zu denselben Werten für Kontrollen und Proben; bei
einigen Assays ist die eine Methode jedoch möglicherweise besser geeignet als die
andere. Die Umrechnungsmethode für das DiaSorin Qualitätskontrolllabor ist
%B/B0 gegen log Konzentration. Sie basiert auf einem Smoothed-Spline-
Kurvenanpassungsprogramm.
16.1 Berechnung des Anteils B/B0
a. Den durchschnittlichen I/M-Wert für jeden Kalibrator, jede Kontrolle und
jede unbekannte Probe berechnen.
b. Den durchschnittlichen I/M-Wert der NSB-Röhrchen von allen Zählungen
abziehen.
c. Den korrigierten durchschnittlichen I/M-Wert jedes Kalibrators, Kontrolle
oder unbekannten Probe durch den korrigierten durchschnittlichen I/MWert
des Nullkalibrators teilen und mit 100 multiplizieren.
durchschn. I/M (Kalibrator oder unbekannte Probe) – durchschn. I/M (NSB)
durchschn. I/M (Nullkalibrator) – durchschn. I/M (NSB)
x 100 = B/B0 (%)
45
16.2 Eichkurve
a. Auf halblogarithmischem oder doppeltlogarithmischem Millimeterpapier
prozentuale Bindungen B/B0 (%) für die 1,25 (OH)2D-Kalibratoren auf der
Ordinate (y-Achse) gegen die Kalibratorkonzentration auf der Abszisse
(x-Achse) auftragen.
HINWEIS: Für die Datenanalyse können auch automatische
Datenreduktionsprogramme verwendet werden. DiaSorin verwendet
Multi-Calc (Pharmacia) mit einem LIN-LOG Smooth-SPLINEAnpassungsprogramm.
Andere Datenreduktionsmethoden müssen
validiert werden, bevor sie regelmäßig eingesetzt werden.
b. Durch die Punkte eine Ausgleichsgerade legen.
c. Die Konzentrationen von 1,25-(OH)2D in den Proben aus dem Kurvendiagramm
interpolieren.
d. Wenn eine unbekannte Probe verdünnt wurde, muss der Wert mit dem
entsprechenden Verdünnungsfaktor korrigiert werden.
e. Der angegebene Testbereich beträgt 5,0 bis 200 pg/mL. Alle Werte, die
unter dem niedrigsten Kalibratorwert (5,0 pg/mL) liegen, sind extrapolierte
Werte und können als “unter 5 pg/mL” angegeben werden.
f. Die maximale Bindung wird berechnet, indem der I/M-Wert des Nullkalibrators
durch die in den Totalaktivität-Röhrchen erhaltenen Gesamtzählungen
dividiert wird.
46
TABELLE I und ABBILDUNG 1 zeigen typische Probendaten für den 1,25-(OH)2D
RIA; diese Informationen dienen nur zu Referenzzwecken und sollten nicht zur
Berechnung von Probenwerten verwendet werden.
TABELLE IV
DiaSorin 1,25-(OH)2D RIA Probendaten
Röhrchen
Doppelte
I/M
Durchschn.
I/M
Korrigierte
I/M
Prozent
Gebunden
(B/T)
Prozent
(B/B0)
Konz.
(pg/mL)
Totalaktivität 40.792 40.685
40.578
NSB 1.438 1.439 3,5
1.439
Nullkalibrator 18.006 18.063 16.624 44,4 100,0
18.119
Kalibratoren
(pg/mL)
1 (5,0) 16.710 16.740 15.302 92,0
16.770
2 (15,0) 14.941 14.929 13.490 81,2
14.916
3 (30,0) 13.087 13.106 11.667 70,2
13.124
4 (75,0) 9.820 9.793 8.354 50,2
9.765
5 (200) 6.412 6.438 5.000 30,0
6.464
Kontrollen
Stufe 1: 13.275 13.403 11.964 72,0 27,3
Normalbereich 13.530
Stufe 2: 8.206 8.165 6.727 40,5 119
Hoher Bereich: 8.124
47
DiaSorin 1,25-(OH)2D RIA Proben-Eichkurve
ABBILDUNG 1
DATENREDUKTION
Das Qualitätskontrolllabor von DiaSorin verwendet eine geglättete Spline-
Kurvenanpassung.
17. GRENZEN DES VERFAHRENS
17.1 Die Zählzeiten sollten ausreichend lang sein, um Fehler zu vermeiden
(2.000 I/M ergeben z. B. 5% Fehler; 10.000 I/M ergeben 1% Fehler).
17.2 Die Testergebnisse sollten in Verbindung mit anderen klinischen und
labordiagnostischen Daten verwendet werden, um den Arzt dabei zu unterstützen,
individuelle Patientenmanagement-Entscheidungen zu treffen.
17.3 Die Leistungsmerkmale dieses Assays konnten bei Kindern und Jugendlichen
nicht nachgewiesen werden.
18. ERWARTETE WERTE
Referenzintervall bei normalen Spendern
Es ist wichtig, dass jedes Labor sein eigenes Referenzintervall festlegt, das für seine
typische Population repräsentativ ist. Die 1,25-(OH)2D-Werte wurden jedoch von
123 scheinbar gesunden Freiwilligen aus drei Städten des mittleren Westens der USA
in einer klinischen Studie gewonnen, die in den Sommer- und Herbstmonaten an drei
Zentren durchgeführt wurde. 37 dieser 123 gesunden Spender unterschiedlicher Rasse
waren männlich, 86 waren weiblich. Der Altersbereich betrug 21-68 Jahre. Der mittlere
1,25-(OH)2D-Wert für die gesamte Probe (n=123) war 43,9 pg/mL. Das mit einer
nichtparametrischen Methode geschätzte 95%-Referenzintervall (nach CLSI-Richtlinie
C28-A215) war 25,1-66,1 pg/mL.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 10 100 1000
pg/mL
% B/Bo
48
Patienten mit Niereninsuffizienz im Endstadium
Es wurde eine klinische Studie durchgeführt, um die Konzentrationen von 1,25-(OH)2D
zu bestimmen, die bei einer Erwachsenenpopulation mit Niereninsuffizienz im
Endstadium festgeslt werden würden. Es wurden die Proben von 87 solcher Probanden
(49 männlich, 38 weiblich, 19-84 Jahre alt) aus drei Städten des mittleren
Westens der USA untersucht. Der beobachtete Bereich der 1,25-(OH)2D-Werte für
diese Probe (n=87) war 1,6-17,3 pg/mL. Die obere Grenze des mit der nichtparametrischen
Methode geschätzten 95%-Referenzintervalls liegt bei 14,2 pg/mL.
19. TESTCHARAKTERISTIKA
19.1 Präzision
Die Assay-Präzision wurde von DiaSorin nach den Grundsätzen der CLSI-Richtlinie
(EP5-A) ermitt.16 Drei Kontrollstufen auf Humanserumbasis mit über den Assay-
Bereich verteilten 1,25-(OH)2-D-Konzentrationen wurden an 25 Assay-Tagen, d. h. an
mehr als 60 Arbeitstagen, untersucht. An der Untersuchung waren mehrere Personen
beteiligt. Darüber hinaus wurden für alle Komponenten mehrere Chargennummern
verwendet. Die per Varianzanalyse (ANOVA) ausgewerteten Ergebnisse sind in der
folgenden Tabelle zusammengefasst.
Intra-Assay
Von Tag
zu Tag Gesamt
Probe N
Mitwert
pg/mL S.A. % VK S.A. % VK S.A. % VK
NIEDRIG 25 25,8 1,76 6,8 3,8 14,6 4,0 15,3
MIT 25 41,3 3,16 7,7 4,6 11,1 5,1 12,3
HOCH 25 105,2 11,86 11,3 11,8 11,2 14,4 13,7
19.2 RICHTIGKEIT: DIE RICHTIGKEIT DES ASSAYS WURDE MIT HILFE DES
LINEARITÄTS- UND WIEDERFINDUNGSTESTS ÜBERPRÜFT.
Linearität (Parallelität)
Die Linearität der Verdünnung wurde von DiaSorin in Übereinstimmung mit den
Empfehlungen der CLSI-Richtlinie EP6-P evaluiert.17 Drei Serumpatienten-probenpools
wurde durch Serienverdünnung mit Nullkalibrator vorbereitet und die Aliquots
bei –20°C einzeln eingefroren. Jede Probe und Verdünnung wurde in mehreren
Replikaten an drei verschiedenen Testdaten untersucht. Die erwarteten Werte wurden
bestimmt, indem die unverdünnten Werte jedes Probenpools mit dem
Verdünnungsfaktor multipliziert wurden. Die Daten sind unten zusammengefasst. Die
Ergebnisse wurden als lineare Regression des erwarteten gegenüber dem
beobachteten Wert aufgetragen.
49
Probe Nr. Verdünnung
Erwarteter Wert
(pg/mL) (N=10)
Mittlerer
Beobachteter Wert
(pg/mL) (N=10)
1 UNVERDÜNNT 49,6 49,6
1:2 24,8 25,3
1:4 12,4 11,1
1:8 6,2 4,4
2 UNVERDÜNNT 50,2 50,2
1:2 25,1 24,2
1:4 12,6 12,2
1:8 6,3 4,6
3 UNVERDÜNNT 62,0 62,0
1:2 31 31,9
1:4 15,5 13,4
1:8 7,8 6,2
WIEDERFINDUNG
Die Fähigkeit des Assays, alle Analyten in den klinischen Proben quantitativ
wiederzufinden, wurde durch Zugabe unterschiedlicher Mengen eines frisch vorbereiteten
reinen 1,25-(OH)2-D-Antigens zu den drei Patientenprobenpools evaluiert. Es
wurden drei Konzentrationen gewählt und in doppelter Ausführung untersucht.
Anschließend wurde die Wiederfindungsrate bestimmt. Die durchschnittliche Wiederfindungsrate
betrug 101 %.
Probe Nr.
Init. Konz.
(pg/mL)
1,0 mL
Spike-
Menge (pg)
*Erwartet
(pg/mL)
Beobachtet
(pg/mL)
Wiederfindungsrate
1 50,0 77,7 75,6 97
30,8 62,5 88,9 87,2 98
75,0 99,8 103 103
2 50,0 89,2 89,5 100
42,8 62,5 100,3 98,9 99
75,0 111,0 118 106
3 50,0 86,8 83,9 97
40,3 62,5 97,9 103 105
75,0 108,8 118 108
*Bei der Berechnung der erwarteten Konzentration wurde der von der Spike-Lösung
eingebrachte Verdünnungsfaktor berücksichtigt.
19.3 Analytische Sensitivität
Die Sensitivität dieses Assays, definiert als die niedrigste von Null zu unterscheidende
Menge bei zweifacher Standardabweichung unter dem mittleren I/M-Wert des Nullkalibrators
(n=20), ist gleich oder weniger <2,0 pg/mL.
50
19.4 Analytische Spezifität
Die Kreuzreaktivität des in diesem Kit verwendeten Antiserums wird ausgedrückt als
das Verhältnis der 1,25-(OH)2D3-Konzentration zur Konzentration der kreuzreaktiven
Substanz bei 50%iger Inhibierung der maximalen Bindung.
Analyt Konz. bei 50% B/Bo % Kreuzreaktivität
24,25 D3 76.420 pg/mL <0,5
25,26 D3 24.330 pg/mL <0,5
25 D3 >>>1 mg/mL <0,5
19.5 Störende Substanzen
Es wurde eine Interferenzstudie durchgeführt, um zu bestimmen, ob erhöhte
Konzentrationen häufig vorkommender endogener Substanzen die Assay-Ergebnisse
negativ beeinflussen können. Die Evaluierung erfolgte in Übereinstimmung mit den
CLSI-Richlinien (EP7-P).18 Es wurden drei Proben auf Humanserumbasis mit niedrigen,
mittleren oder hohen Konzentrationen von 1,25-(OH)2-D3 entweder mit Zusätzen der
Testsubstanz oder als mit identischen Volumen der Testsubstanz versetzten Kontrollen
untersucht. Jede Probe wurde zweimal extrahiert und ergab vier Replikate. Die unten
dargeslten Ergebnisse zeigen, dass es keine Interferenzen durch eine der
getesteten Substanzen gab. Die Bestimmung erfolgte durch statistisches Testen mit
ANOVA (95%-Konfidenzintervall) oder über den Mitwert der versetzten Proben, die
den für die Kontrollen ermitten Standardabweichungsbereich um mehr als ± 2
überschritten.
Bilirubin
Probe Nr.
Kontrolle
MW (pg/mL)
Kontrolle 2
SA-Bereich
Bilirubin MW
(pg/mL)
Interferenz
ANOVA
Niedrig 19,9 18,5-21,3 19,5 0,54
Mit 31,7 27,7-35,7 29,9 0,22
Hoch 79,7 63,5-95,9 83,2 0,45
Cholesterin
Probe Nr.
Kontrolle
MW (pg/mL)
Kontrolle 2
SA-Bereich
Cholesterin
MW (pg/mL)
Interferenz
ANOVA
Niedrig 19,9 18,5-21,3 19,4 0,64
Mit 31,7 27,7-35,7 29,7 0,15
Hoch 79,7 63,5-95,9 75,2 0,40
Triglycerid
Probe Nr.
Kontrolle
MW (pg/mL)
Kontrolle 2
SA-Bereich
Triglycerid
MW (pg/mL)
Interferenz
ANOVA
Niedrig 14,7 12,9-16,5 15,1 0,88
Mit 30,4 22,4-38,4 33,4 0,25
Hoch 92,6 69,5-116,9 95,4 0,68
Hämoglobin
Probe Nr.
Kontrolle
MW (pg/mL)
Kontrolle 2
SA-Bereich
Hämoglobin
MW (pg/mL)
Interferenz
ANOVA
Niedrig 21,5 17,5-25,5 20,8 0,53
Mit 38,6 35,4-41,8 40,0 0,43
Hoch 112,7 101,4-124,0 120,6 0,17
51
Harnstoff
Probe Nr.
Kontrolle
MW (pg/mL)
Kontrolle 2
SA-Bereich
Harnstoff
MW (pg/mL)
Interferenz
ANOVA
Niedrig 25,1 20,9-29,3 26,6 0,39
Mit 36,2 23,8-48,6 35,9 0,96
Hoch 120,1 97,4-142,8 118,6 0,82
LITERATURANGABEN FINDEN SIE AUF DER LETZTEN SEITE
TESTSCHEMA
1. Alle Kalibratoren, Kontrollen und unbekannten Proben werden nach dem
Trocknungsschritt des Säulenverfahrens mit 95%igem Ethanol und Tracer
rekonstituiert.
2. Reagenzien wie folgt dispensieren:
Röhrchen/Reagenzien Totalaktivität NSB Kal
0-5
Kontrollen und
unbekannte
Proben
Rekonstituierte
Kalibratoren - - 75 μL -
Rekonstituierte Kontrollen
und unbekannte Proben - - - 75 μL
95%iges Ethanol und
Tracer ** 75 μL 75 μL - -
NSB-Puffer - 300 μL - -
1,25-(OH)2-D Antiserum - - 300 μL 300 μL
HINWEIS: Totalaktivität- und NSB-Röhrchen werden durch Zugabe von 50 μL
95%igem Ethanol mit 125 μL Tracer und durch Pipettieren von 75 μL dieser Mischung
in doppelte Teströhrchen hergeslt.
3. Gut mischen; 2 Stunden lang (+/- 15 Minuten) bei 20-25°C inkubieren.
4. 500 μL präzipitierendes Ziege-anti-Kaninchen-Reagenz in alle Röhrchen
außer den Totalaktivität-Röhrchen dispensieren.
5. Gut mischen; 20 (+/- 5) Minuten lang bei 20-25°C inkubieren.
6. Mit 1800 x g* 20 Minuten lang bei 20-25°C zentrifugieren.
7. Die Überstände dekantieren.
8. Alle Röhrchen in einem Gammazähler 1 Minute messen.
*g = (1118 x 10-8) (Radius in cm) (U/min)2
52
EQUIPO RIA PARA 1,25-DIHIDROXIVITAMINA D 125I
1. USO INDICADO
PARA UTILIZACIÓN EN DIAGNÓSTICOS IN VITRO
El equipo RIA 1,25-Dihidroxivitamina D 125I es un ensayo radioinmunológico que tiene
como finalidad la determinación cuantitativa de 1,25-dihidroxivitamina D (1,25-(OH)2-D)
en suero humano o plasma EDTA para utilizarlo en la evaluación de deficiencia de
1,25-(OH)2-D asociada con enfermedades renales. Los resultados del ensayo deben
utilizarse junto con otros datos clínicos y de laboratorio para ayudar al médico en la
toma de decisiones para el tratamiento individual de pacientes en población adulta.
2. RESUMEN Y EXPLICACIÓN
La vitamina D procede de 2 fuentes: exógena (de la dieta) y endógena (biosíntesis,
regulada por la exposición a la luz ultravioleta). La fuente exógena o nutricional incluye
alimentos que contengan de forma natural niveles bajos de vitamina D2 (p. ej. leche,
mantequilla, cereales con suplemento de vitamina D2 ), suplementos alimenticios en
forma de vitaminas de venta sin receta y fórmulas terapéuticas de las vitaminas D2 .1
La acción de la vitamina D no es inherente al entrar en circulación por vía dietética o
fotoquímica. La actividad biológica se alcanza tras una compleja serie de pasos
metabólicos.2
En la actualidad se sabe que la activación metabólica de la vitamina D consiste en un
complicado proceso controlado, sujeto a importantes alteraciones debido a variables
que incluyen el calcio y el fósforo de la dieta, el grado de deficiencia de vitamina D,
deficiencias genéticas, concentraciones de hormona paratiroides, exposición a los
rayos ultravioleta y grado de funcionamiento renal.3 La biosíntesis de las formas
dihidroxiladas de vitamina D3 comienza con la acción de la luz ultravioleta solar sobre
el 7-dehidrocolesterol para formar vitamina D3 en la piel. Una vez que la vitamina D3
entra en circulación es absorbida rápidamente por el hígado donde se metaboliza a
25-hidroxivitamina D3 (25-OH-D3). El hígado también hidroxila la vitamina D2 de la dieta
para formar 25-hidroxivitamina D2 (25-OH-D2).2,4
Tras la hidroxilación hepática, la 25-OH-D se transporta junto con una proteína de
unión de la vitamina D hasta el riñón, donde sigue produciéndose hidroxilación.
La adición de un grupo hidroxilo en la posición 1 produce 1,25-dihidroxivitamina D
(1,25-(OH)2-D). Ésta es la vitamina D más potente encontrada hasta la fecha y su
producción está estrictamente controlada por la concentración en suero de calcio,
fósforo y hormona paratiroides. En los momentos de estrés cálcico, la 1,25-(OH)2-D es
la vitamina D más importante producida por el riñón.5,6
Esto es debido a su papel esencial en la absorción activa efectiva del calcio y el
fósforo, así como en su metabolismo normal. Por consecuencia, la medición de
1,25-(OH)2-D está convirtiéndose en una eficiente herramienta en la investigación de
enfermedades y condiciones que afectan al metabolismo normal del fósforo y el
calcio.7,8,9
3. PRINCIPIO DEL ENSAYO
El ensayo DiaSorin 1,25-(OH)2-D es un procedimiento de dos pasos. Incluye una
extracción preliminar y la subsiguiente purificación de los metabolitos de vitamina D del
suero o plasma EDTA mediante cartuchos C18OH.10 Tras la extracción, la muestra
tratada se somete a un ensayo con un competitivo procedimiento RIA. El método RIA
se basa en un anticuerpo policlonal específico tanto para 1,25-(OH)2 D2 y 1,25-(OH)2D3.
La muestra, el anticuerpo y el trazador, se incuban durante 2 horas entre 20 y 25°C. La
fase de separación se alcanza tras una incubación de 20 minutos entre 20 y 25°C con
un segundo complejo de precipitación de anticuerpos. Tras la centrifugación y
decantación, la parte unida remanente en la pastilla se cuenta en un contador gamma.
53
Los valores se calculan de forma directa a partir de una curva de calibrador de
concentraciones conocidas. La concentración final de 1,25-(OH)2D en las muestras de
suero y plasma EDTA se expresa en pg/mL.
4. REACTIVOS SUMINISTRADOS CON EL EQUIPO
TAMPÓN NSD 1,25-(OH)2D 1 vial / 3 mL
CALIBRADOR 0 1,25-(OH)2D 1 vial / 20 mL
CALIBRADOR 1 - 5 1,25-(OH)2D3 5 viales / 3 mL
ANTISUERO 1,25-(OH)2D 1 frasco / 35 mL
125 I 1,25-(OH)2D3 1 vial / 10 mL
SOLUCIÓN DE TRATAMIENTO PREVIO 1,25-(OH)2D3
1 frasco / 50 mL
COMPLEJO DE PRECIPITACIÓN GAR 1,25-(OH)2D 2 viales / 35 mL
SUERO DE CONTROL 1,25-(OH)2D 2 viales / 3 mL
ETANOL 95% 1 vial / 7 mL
Número de pruebas 100
ALMACENAMIENTO: Tras su recepción, el equipo debe almacenarse a 2-8°C. Una
vez abiertos, almacene los reactivos a 2-8°C hasta la fecha de vencimiento que figura
en la etiqueta. Los reactivos no deben utilizarse después de la fecha de vencimiento.
La fecha de vencimiento del equipo se indica en la etiqueta externa y se corresponde
con la fecha de vencimiento del trazador.
Cuando reconstituya el contenido de los viales, mezcle suavemente para evitar la
formación de espuma. Almacene todos los reactivos reconstituidos a -15°C o menos
inmediatamente después de usarlos. No deben mezclarse reactivos de diferentes
lotes.
4.1 Tampón NSB 1,25-(OH)2D: reactivo listo para utilizar
Tampón de gelatina de fosfato de potasio que contiene ProClin 300 (< 0,2%).
4.2 Calibrador 0 1,25-(OH)2D: reactivo listo para utilizar
Tampón de fosfato que contiene proteínas de suero bovino y ProClin 300 (< 0,2%).
4.3 Calibrador (1-5) 1,25-(OH)2D3: reactivo liofilizado
Cinco calibradores liofilizados (1,25-(OH)2D3) en concentraciones entre 5 y 200 pg/mL
que contienen suero humano y ProClin 300 (<0,2%). Reconstituya cada calibrador con
3,0 mL de calibrador 0. La concentración exacta se indica en la etiqueta del vial. Los
calibradores del equipo están ajustados con cuantificación UV. Los calibradores del
equipo han demostrado tener conmutabilidad con muestras de pacientes cuando se
utilizan con los reactivos y el procedimiento recomendados para esta prueba de
diagnóstico in vitro.
4.4 Antisuero 1,25-(OH)2D: reactivo listo para utilizar
Suero anti-1,25-(OH)2D de conejo diluido en tampón de gelatina de fosfato que
contiene ProClin 300 (<0,2%).
4.5 125I 1,25-(OH)2D3 reactivo listo para utilizar
1,25-(OH)2D3 radio yodado análogo diluido en un tampón de etileno glicol fosfato.
4.6 Solución de tratamiento previo 1,25-(OH)2D3: reactivo listo para utilizar
Tampón de fosfato de potasio.
54
4.7 Controles 1,25-(OH)2D: nivel 1 (Normal), nivel 2 (Elevado): reactivo listo para
utilizar
Mezcla de suero humano procesado que contiene ProClin 300 (<0,2%), con las
cantidades apropiadas de 1,25-(OH)2D para obtener concentraciones de control
dentro de los rangos especificados. El control 1 está dentro del rango normal y el
control 2 está dentro de un rango elevado. El rango de concentraciones de cada
control aparece en el certificado de análisis, e indica los límites definidos por DiaSorin
para los valores de control que se pueden obtener a partir de ensayos fiables.
4.8 Complejo de precipitación GAR (Goat Anti-Rabbit): reactivo liofilizado
El suero de conejo normal previamente precipitado con suero anti-conejo y
polietinglicol (PEG) está diluido con tampón borato-ASB con azida sódica al 0,1% y
otros conservantes (liofilizado). Reconstituya el vial con 35 mL de agua destilada
desionizada; mezcle hasta que la suspensión sea homogénea y deje reposar al menos
durante 30 minutos a temperatura ambiente removiendo cada cierto tiempo.
4.9 Etanol 95%: reactivo listo para utilizar
95% de etanol y 5% de agua.
NOTA: También son necesarios cartuchos C18OH para este procedimiento.
Dichos cartuchos deben solicitarse por separado con el número de pedido de
DiaSorin 65101E.
5. ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES
PARA UTILIZACIÓN EN DIAGNÓSTICOS IN VITRO
No debe destinarse al uso interno o externo en seres humanos ni animales.
PRECAUCIÓN: Este producto sólo deben recibirlo, adquirirlo, poseerlo y utilizarlo
médicos, laboratorios clínicos, hospitales u organismos de investigación. Las pruebas
debe realizarlas únicamente el personal de laboratorio debidamente competente y
capacitado.
REACTIVOS QUE CONTIENEN MATERIAL DE ORIGEN HUMANO
Trátese como potencialmente infeccioso.
Todas las unidades de donantes de suero/plasma se han probado en conformidad con
un método aprobado por la FDA estadounidense y han dado resultados negativos para
la presencia de AgsHB, anticuerpos de VHC y anticuerpos de VIH 1/2. Aunque estos
métodos son altamente precisos, no garantizan que se detecten todas las unidades
infectadas. Este producto también puede contener otros materiales de origen humano
para los cuales no existe prueba homologada. Dado que ningún método de prueba
puede ofrecer una seguridad total de la ausencia del virus de la hepatitis B, de la
hepatitis C (VHC), el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) u otros agentes
infecciosos, todos los productos que contengan material de origen humano se deben
manejar de acuerdo con las prácticas de laboratorio correctas utilizando las
precauciones adecuadas que se describen en el manual “Biosafety in Microbiological
and Biomedical Laboratories”, 4a ed., mayo 1999 o actual, por Centers for Disease
Control and Prevention/National Institutes of Health.
REACTIVOS CON CONTENIDO DE AZIDA SÓDICA
PRECAUCIÓN: Algunos reactivos de este equipo contienen azida sódica. La azida
sódica puede reaccionar con las cañerías de plomo y cobre y formar azidas metálicas
altamente explosivas. Al desecharlo, enjuague con abundante agua para evitar que se
acumule la azida. Para obtener información adicional, consulte “Decontamination of
Laboratory Sink Drains to Remove Azide Salts,” en el manual Guide-Safety
Management Nº CDC-22 publicado por Centers for Disease Control and Prevention,
Atlanta, GA, EE.UU. 1976.
55
Advertencias establecidas en la Comunidad Europea sobre el riesgo de
sustancias peligrosas (Directiva del Consejo 1999/45/EC)
R 20/21/22 - Nocivo por inhalación, por ingestión y en contacto con la piel.
R 32 - En contacto con ácidos libera gases altamente tóxicos.
S28 - En caso de contacto con la piel, lávese inmediatamente con abundante agua.
REACTIVOS CON CONTENIDO DE ETANOL
Advertencias establecidas en la Comunidad Europea sobre el riesgo de
sustancias peligrosas (Directiva del Consejo 1999/45/EC)
R11 - Altamente inflamable
S16 - Manténgase alejado de fuentes de ignición. No fumar.
S43 - En caso de incendio, utilícense productos químicos secos o dióxido de carbono.
REACTIVOS CON CONTENIDO DE YODO-125
Este equipo contiene material radiactivo que no supera 5,5 μCi (204 kBq) de yodo-125.
Para almacenar, manejar y desechar este material, deben adoptarse las precauciones
necesarias y prácticas de laboratorio correctas.
Para facultativos o instituciones que reciben radioisótopos con licencia genérica:
Este material radiactivo sólo deben recibirlo, adquirirlo, poseerlo y utilizarlo médicos,
laboratorios clínicos u hospitales, y sólo para pruebas in vitro clínicas o de laboratorio
que no conlleven la administración interna o externa del material ni su radiación a
seres humanos ni animales. Su recepción, adquisición, posesión, uso y transferencia
se rigen por la normativa y la licencia genérica de la Comisión Reguladora Nuclear del
estado en el que la Comisión haya llegado a un acuerdo para el ejercicio de su
autoridad reguladora.
1. El almacenamiento del material radiactivo debe limitarse a un área destinada
específicamente a tal efecto.
2. El acceso a materiales radiactivos debe estar limitado a personal autorizado
únicamente.
3. No recoja material radiactivo con la pipeta usando la boca.
4. No coma ni beba dentro de las áreas destinadas a trabajos radiactivos.
5. Las áreas donde puedan producirse derrames deben enjugarse y después
lavarse con un detergente alcalino o una solución decontaminante radiológica.
Todo recipiente de vidrio utilizado debe enjuagarse completamente con agua
antes de lavarse con otros recipientes de laboratorios.
Para facultativos o instituciones que reciben radioisótopos con licencia específica:
La recepción, uso, transferencia y eliminación de los materiales radiactivos se rigen
por la normativa y las condiciones de la licencia en cuestión.
ADVERTENCIA: Este producto contiene una sustancia química conocida por el
Estado de California como causante de cáncer.
ATENCIÓN: La radiactividad impresa en el interior del paquete puede diferir
ligeramente de la impresa en la etiqueta de la caja y en la del vial del trazador. La
etiqueta de la caja y la del trazador indican la cantidad real de radiactividad en la fecha
de la calibración, mientras que el impreso del interior del paquete indica la
radiactividad teórica del equipo.
6. INDICACIONES DE POSIBLE DETERIORO DE LOS REACTIVOS DEL
EQUIPO
6.1 Presencia de partículas anómalas en alguno de los reactivos.
6.2 Desviación en la pendiente o posición de la curva del calibrador con respecto
al resultado habitual.
6.3 Disminución de la unión máxima.
6.4 Alto nivel de uniones no específicas.
56
7. RECOGIDA Y PREPARACIÓN DE SUERO Y PLASMA
El equipo 1,25-Dihidroxivitamina D precisa 500 μL de suero o plasma EDTA para
realizar la extracción para el ensayo; un volumen de 1,5 mL permitirá repetir el ensayo
y proporciona la dosificación adecuada.
Con este equipo puede utilizarse suero o plasma humanos. Con este ensayo puede
utilizarse el anticoagulante EDTA. Es recomendable tomar la muestra en ayunas,
pero no es imprescindible. La sangre debe recolectarse asépticamente por punción
venosa en un tubo de vidrio vacío de 5 ó 10 mL. Para el suero, deje que la sangre
coagule a temperatura ambiente (15-25°C). Centrifugue durante 15 minutos con
aproximadamente 760 x g* para obtener suero no hemolizado. Para mantener la
integridad de la muestra no se requieren aditivos ni conservantes. Todos los
materiales de plástico, vidrio u otros que entren en contacto con la muestra deben
estar completamente limpios de contaminación.
Almacene las muestras de suero o plasma a -15°C o menos. No debe congelar y
descongelar las muestras de forma reiterada. No obstante, un estudio realizado por
DiaSorin mostró que no se produce un cambio significativo en los valores en muestras
que se han congelado y descongelado 3 veces. Se han conservado muestras hasta
6 meses a 15°C o menos sin que se produzcan cambios significativos en los
resultados.
8. EQUIPO Y MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS
8.1 Cartuchos C18OH (24 unidades) pedidos por separado con el número de
pedido DiaSorin 65101E.
8.2 12 tubos desechables de vidrio de borosilicato, 12 x 75 mm y 13 x 100 mm.
8.3 Portatubos.
8.4 Parafilm o un equivalente para cubrir los tubos de ensayo.
8.5 Portatubos de espuma o equivalente.
8.6 Centrífuga con capacidad para 12 tubos de 75 mm a 1800 x g*.
8.7 Contador gamma válido para yodo 125.
8.8 Mezclador vórtex.
8.9 Utensilios de dosificación:
a. Micropipetas calibradas para suministrar 75 μL, 300 μL y 500 μL.
b. Dispensadores de repetición para suministrar 50 μL, 300 μL, y 500 μL.
c. Pipetas volumétricas para reconstituir calibradores, 3,0 mL.
8.10 Agua desionizada o destilada.
8.11 Disolventes orgánicos:
Para la preparación y extracción de muestras se precisarán los siguientes
disolventes.
Utilice solo disolventes de grado HPLC.
No exponga los disolventes orgánicos a materiales de vidrio lavados con
ácido ni a otras condiciones de acidez.
a. Acetonitrilo.
b. Metanol.
c. Hexano. (IMPORTANTE: el porcentaje de n-hexano debe ser superior al
95%)
d. Cloruro de metileno (no debe contener alcohol como conservante).
e. Isopropanol (2-propanol).
* g = (1118 x 10-8 ) (radio en cm) (rpm)2
57
8.12 Dispositivo recomendado para los cartuchos C18OH:
a. Estación de procesamiento de muestras Vac Elut. Procesa 24 columnas
en cada ciclo. Puede solicitarse a Analytichem International o a DiaSorin.
Para pedirla a DiaSorin, utilice el número de pedido DiaSorin 11610.
8.13 Material necesario para secar muestras:
a. Nitrógeno gaseoso.
b. Colector de secado con baño de agua o bloque calentador a 37°C (±2°C):
N-EVAP o MULTI-VAP disponible a través de Organomation Associates
(Berlín, MA) o Reacti-Vap II y Reacti-Therm III disponibles a través Pierce
Chemical Company (Rockford, IL).
9. PREPARACIÓN DE DISOLVENTES ORGÁNICOS PARA LA EXTRACCIÓN
DE COLUMNAS
NOTA: Las mezclas de disolventes orgánicos deben prepararse antes de iniciar
el procedimiento de extracción preliminar.
PRECAUCIONES:
Prepare mezclas de disolventes como se describe en la TABLA I; DiaSorin recomienda
la preparación de 500 mL de disolución. Es posible preparar cantidades diferentes
siempre que se respeten las proporciones. No obstante, los volúmenes deben ser
suficientemente grandes como para minimizar posibles errores de medida. Mida cada
disolvente de forma independiente para lograr mejores resultados.
PRECAUCIONES:
Utilice agua destilada o desionizada cuando proceda.
TABLA I
Preparación disolvente
Mezcla disolvente Materiales 1 L 500 mL
metanol 700 mL 350 mL
70:30 agua 300 mL 150 mL
hexano 900 mL 450 mL
90:10 cloruro de metile00 mL 50 mL
hexano 990 mL 495 mL
99:1 Alcohol isopropílico 10 mL 5 mL
hexano 920 mL 460 mL
92:8 Alcohol isopropílico 80 mL 40 mL
10. PROCEDIMIENTO DE EXTRACCIÓN PRELIMINAR
10.1 Reconstituya cada calibrador liofilizado con 3,0 mL de calibrador cero. Mezcle
bien los calibradores y deje reposar durante 15 a 20 minutos para asegurar
una completa reconstitución. Descongele por completo los reactivos
congelados. Deje que todos los reactivos alcancen la temperatura ambiente.
No permita que los reactivos alcancen temperaturas superiores a los 25°C.
Mezcle bien todos los reactivos antes de utilizarlos.
10.2 Dosifique 500 μL de cada calibrador (0-5), control y muestra del paciente en
los 12 tubos etiquetados de vidrio de borosilicato de 75 mm.
10.3 Añada 500 μL de acetonitrilo a cada muestra; utilice el mezclador vórtex de
forma intermitente al menos 3 veces durante 10 minutos.
58
10.4 Centrifugue los tubos a 760 x g* durante 10 minutos a 20 - 25°C.
10.5 Decante los sobrenadantes de la muestra en los 12 tubos etiquetados de
75 mm o los 13 de 100 mm (si lo prefiere); deseche las pastillas.
10.6 Añada 500 μL de disolución de tratamiento previo a cada tubo y al mezclador
vórtex.
NOTA: Este equipo está diseñado para colocar hasta 48 extracciones
incluidos los controladores y controles y 40 desconocidos. Esto quiere decir
que pueden extraerse 24 muestras en el VacElut de forma inmediata y las
24 restantes pueden extraerse más adelante. Las extracciones de columna
deberían realizarse tan pronto como sea posible tras la adición del tratamiento
previo. Sin embargo, una vez extraída la columna, las muestras pueden
almacenarse durante 96 horas a -15°C o menos.
10.7 Ahora, las muestras están listas para aplicarlas a los cartuchos C18OH.
11. PROCEDIMIENTO DE COLUMNA
11.1 Para obtener una descripción del VAC ELUT, consulte su Manual de usuario.
Monte la estación tal como se indica.
11.2 Etiquete un tubo de vidrio de borosilicato de 13 x 100 mm para cada
calibrador (0-5), control y muestra desconocida. Coloque dichos tubos en el
VAC ELUT. Compruebe que la tapa del VAC ELUT está en la posición
“WASTE” y que los tubos están colocados para recoger los eluatos deseados.
Coloque los cartuchos C18OH en la cubierta del VAC ELUT.
11.3 Añada las mezclas de disolventes a los cartuchos específicos tal como se
describe en la TABLA II.
IMPORTANTE:
Utilización del vacío:
Accione el vacío tras cada adición de disolvente y permita que la mezcla de
disolvente fluya por completo a través del cartucho antes de pasar al siguiente
disolvente. Active y desactive el vacío en los pasos recomendados en la
TABLA II (si se prefiere, el vacío puede desactivarse tras cada adición de
disolvente).
El vacío debe ajustarse a 10 pulgadas (254 mm de Hg) o menos. Deje salir cada
mezcla de disolvente a través de la salida “WASTE” a contenedores apropiados
hasta el paso de recolección final.
Aplicación de muestra:
Las muestras pueden decantarse directamente sobre el cartucho o bien aplicarse
con una pipeta.
No deje que el cartucho se seque al aire durante más de 5 minutos entre
aplicaciones.
Tratamiento previo con cartucho C18OH:
Los cartuchos C18OH deben lavarse con 5 mL de disolución 90:10 (hexano:
cloruro de metileno), 5 mL de alcohol isopropílico y 5 mL de metanol antes de
utilizarlos por primera vez. Para preparar la mezcla de disolventes 90:10
(hexano: cloruro de metileno) mida 900 mL de hexano y 100 mL de cloruro de
metileno. Coloque los cartuchos nuevos, sin utilizar, en el aparato VAC ELUT,
ajuste la posición “WASTE” y añada 5 mL de disolución 90:10 (hexano: cloruro
de metileno) seguido de 5 mL de alcohol isopropílico y, a continuación, 5 mL
metanol. Deje que cada mezcla de disolventes pasa por completo a través de los
cartuchos antes de comenzar con la mezcla siguiente. Tras esta preparación
inicial no será necesario repetir este paso ya que los cartuchos se regeneran
durante el procedimiento de extracción.
* g = (1118 x 10-8 ) (radio en cm) (rpm)2
59
NOTA: Si es preciso extraer muestras adicionales (más de 24), regenere los
cartuchos con el método descrito en la TABLA II. Los cartuchos pueden
reutilizarse hasta 30 veces.
NOTA: El material del cartucho C18OH se sujeta mediante una frita de fibra
porosa. Deseche los cartuchos con fritas sueltas o en los que falte alguna ya que
podría perderse el material C18OH.
TABLA II
Descripción y análisis de la
extracción
Pasos de la extracción Tratamiento de
eluyentes
1. Añada 1 mL de metanol,
active el vacío
Preparación de columna /
regeneración Elimina: sustancias
que interfieren de utilizaciones previas
(paso 1) 2. Desactive el vacío.
Deseche
“WASTE”
Aplicación de muestra
3. Aplique todas las muestras,
active el vacío.
Procedimiento de extracción
preliminar (paso 10).
Deseche
“WASTE”
Purificación/eliminación de
metabolitos de vitamina D
4. Añada 5 mL de disolución
70:30 metanol/agua
(desionizada o destilada).
Elimina: pigmentos, sales y lípidos
polares que interfieren (paso 4)
5. Añada 5 mL de disolución
90:10 hexano/cloruro de
metileno.
25(OH)D (paso 5) 6. Añada 5 mL de disolución 99:1
hexano/isopropanol.
25(OH)D y 24,25(OH)2 D/25,26(OH)2
D remanentes
(paso 6)
7. Desactive el vacío.
Deseche
“WASTE”
Recogida de 1,25-(OH)2 D IMPORTANTE
Elución de 1,25-(OH)2 D purificado
(paso 9)
8. Ajuste el Vac Elut en la
posición "Collect:"
9. Añada 3 mL de disolución 92:8
hexano/isopropanol, active el
vacío.
10. Desactive el vacío.
“COLLECT”
12. SECADO Y RECONSTITUCIÓN DE ELUATOS
12.1 Coloque los tubos de muestra con eluatos en un bloque calentador o un baño
de agua a 37°C (±2° C) para que se sequen.
12.2 Seque los eluatos bajo un extractor utilizando 2-4 psi de nitrógeno gaseoso
(tiempo de secado, 20-30 minutos).
12.3 Retire los tubos inmediatamente después de que se haya secado el eluato.
60
12.4 Reconstituya cada uno de los extractos secados 50 μL de etanol 95% ; agite
con suavidad en vórtex a velocidad media o baja. Añada 125 μL de trazador
en los tubos que contienen los 50 μL de etanol 95%, agite con suavidad de
nuevo en vórtex a velocidad media a baja. Nota: Los pasos de vórtex son
muy importantes para asegurar que la muestra está correctamente
reconstituida y para lograr un buen nivel de precisión. Precaución: Mantenga
el vórtex en la posición más baja del tubo para evitar la pérdida de volumen
de muestra lo que garantiza suficiente volumen de dosificación para el
ensayo. Etiquete un tubo adicional para cuentas totales y un tubo para NSB.
Añada 50 μL de etanol 95% y 125 μL de trazador en ambos tubos. Esto se
utilizará para crear los tubos duplicados para TC (cuentas totales) y NSB para
la configuración del ensayo.
12.5 Realice el ensayo inmediatamente después de reconstituir las muestras.
Para obtener resultados óptimos cuando se realizan ensayos grandes,
reconstituya 12 - 15 muestras de una vez y dosifique en el ensayo antes de
reconstituir las 12 - 15 siguientes.
13. PROCEDIMIENTO DE ENSAYO
13.1 Disponga 12 tubos etiquetados de vidrio de borosilicato de 75 mm en
duplicado para cada calibrador (0-5), control y muestra de acuerdo con el
esquema del ensayo. Añada con cuidado 75 μL del calibrador reconstituido,
extractos de muestras y control en los tubos de ensayo duplicados.
PRECAUCIÓN: Este paso debe realizarse con cuidado ya que solo se
dispone de 25 μL de excedente en cada tubo.
13.2 Consulte “Secado y reconstitución de eluatos”, paso número 4. Añada 75 μL
del tubo TC (cuentas totales) en los tubos de ensayo duplicados. Repita este
paso para los tubos de ensayo duplicados de NSB.
13.3 Añada 300 μL de tampón NSB a los tubos NSB.
13.4 Añada 300 μL de anticuerpo primario en todos los tubos excepto los tubos de
cuentas totales y de NSB.
13.5 Mezcle bien; incube durante 2 horas (±15 minutos) a 20 - 25°C.
NOTA: Reconstituya el complejo de precipitación GAR con 35 mL de agua
destilada o desionizada, mezcle bien hasta que la suspensión aparezca
homogénea y deje que repose durante un mínimo de 30 minutos antes de
utilizar a temperatura ambiente mezclando ocasionalmente antes y durante la
utilización.
13.6 Añada 500 μL de complejo de precipitación GAR bien mezclado en todos
los tubos excepto en los de cuentas totales. Incube durante 20 minutos
(±5 minutos) a 20 - 25°C.
13.7 Centrifugue todos los tubos durante 20 minutos a 20 - 25°C a 1800 x g*, salvo
los tubos de cuentas totales.
13.8 Decante los sobrenadantes (salvo los tubos de cuentas totales) con un
portatubos de espuma o equivalente volcando el portatubos en un depósito de
residuos adecuado. Coloque el portatubos invertido sobre papel absorbente
durante 2-3 minutos. Seque los tubos con cuidado con papel absorbente para
asegurar la eliminación de todo el líquido.
13.9 Mida la radioactividad contando todos los tubos durante 1 minuto en un
contador gamma. Los tubos deben contarse durante al menos 1 minuto (vea
la sección Limitaciones del procedimiento).
* g = (1118 x 10-8 ) (radio en cm) (rpm)2
61
14.COMENTARIOS SOBRE EL PROCEDIMIENTO
14.1 Añada cada alícuota de reactivo al tercio inferior del tubo de ensayo para
asegurar la mezcla completa de los reactivos.
14.2 Las proporciones correctas de disolvente son cruciales para que las recuperaciones
sean buenas. Prepare disoluciones en volúmenes suficientemente
grandes para minimizar los errores de medida.
14.3 Que el calibrador más alto, debe repetirse el ensayo diluyendo con el
calibrador cero del equipo antes de la extracción. Los resultados deben
multiplicarse por el factor de disolución apropiado. Por ejemplo, mezcle
500 μL de la mezcla con 500 μL del calibrador cero y, a continuación, realice
un ensayo sobre 500 μL de esta mezcla como indica el envoltorio del
producto
14.4 No se ha observado ninguna desviación del ensayo en el tiempo medio que
toma realizar un ensayo de 100 tubos.
14.5 Para que un laboratorio pueda controlar el desempeño uniforme de un ensayo
RIA hay factores adicionales que deben comprobarse. DiaSorin recomienda
comprobar periódicamente los siguientes parámetros para asegurar el
desempeño uniforme del equipo.
a. Cuentas totales
b. Unión máxima
Promedio de cuentas por minuto (CPM) del tubo de calibrador
0/Promedio de CPM de los tubos de cuentas totales.
c. Uniones no específicas
Promedio de CMP de los tubos NSB/Promedio de CPM de los tubos de
cuentas totales.
d. Pendiente de la curva de calibrador
Puede controlarse el 50% de supresión.
15. CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe incluir al menos dos controles (uno de rango normal y otro de
rango elevado) en cada ensayo para supervisar sus resultados. Pueden utilizarse
controles disponibles en el mercado o los dos controles de referencia que se
suministran con el equipo.
Los controles deben tratarse como muestras desconocidas y someterse al ensayo por
duplicado. El laboratorio debe mantener gráficos de control de calidad para llevar un
seguimiento del desempeño del control. Cada laboratorio debe establecer límites de
desempeño aceptables para cada nivel de control mediante métodos estadísticos
diseñados para detectar errores sistemáticos y aleatorios. Los resultados de control
deben cumplir los criterios de aceptabilidad del laboratorio antes de informar los
resultados de las pruebas con pacientes.12,13,14
16. CÁLCULO DE RESULTADOS
Hay numerosos métodos para calcular los resultados de los ensayos RIA. Todos
tienen como finalidad obtener una curva de calibrado que relacione el alcance de la
unión con diferentes concentraciones de los calibradores de calibrado. El gráfico
puede tener una escala lineal o logarítmica. Cada uno de estos métodos indica
básicamente los mismos valores para controles y muestras, aunque algunos ensayos
pueden "ajustarse" mejor a un método determinado que a otro. El método de cálculo
del Laboratorio de Control de Calidad de DiaSorin es B/B0 frente a un método de
concentración logarítmica basado en un programa de ajuste de línea estriada alisada.
62
16.1 Cálculo de porcentaje B/B0
a. Calcule el promedio de CMP de cada calibrador, control y muestra
desconocida.
b. Reste el promedio de CPM de los tubos NSB de todas las cuentas.
c. Divida el promedio de las CPM corregidas de cada calibrador, control o
muestra desconocida por el promedio de las CPM corregidas del
calibrador 0 y multiplique por 100.
prom. CPM (calibrador o muestra desconocida) - prom. CPM (NSB)
prom. CPM (calibrador 0) - prom. CPM (NSB)
x 100 = B/B0 (%)
16.2 Utilización del trazado de la curva de calibrador
a. Con un papel gráfico semilog de 2 ciclos o log-logit, trace el B/B0
porcentual (%) para los calibradores 1,25 (OH)2D en el eje de ordenadas
(eje Y) frente a la concentración de calibradores en el eje de abscisas
(eje X).
NOTA: Para analizar los datos también pueden utilizarse programas
automáticos de reducción de datos. DiaSorin utiliza Multi-Calc
(Pharmacia) con un programa de ajuste suavizado SPLINE LIN-LOG.
Todos los demás métodos de reducción de datos han de ser validados
antes utilizarlos con regularidad.
b. Una los puntos con una línea de ajuste óptimo.
c. Interpole los niveles de 1,25-(OH)2D en las muestras del trazado de los
calibradores.
d. Si alguna muestra desconocida está diluida, corríjala para obtener el
factor de dilución adecuado.
e. El rango que se registra del ensayo es desde 5,0 pg/mL hasta
200 pg/mL. Cualquier valor por debajo del calibrador más bajo,
5,0 pg/mL, es un valor extrapolado y puede registrarse como “inferior a
5 pg/mL”.
f. Calcule la unión máxima dividiendo las CPM del calibrador 0 por el
promedio de cuentas totales obtenido con los tubos de cuentas totales.
63
La TABLA IV y la FIGURA 1 muestran ejemplos de datos típicos de muestras para el
ensayo RIA 1,25-(OH)2D RIA; esta información sólo debe utilizarse como referencia y
no para calcular ningún valor.
TABLA IV
Datos de muestras de ensayo RIA 1,25-(OH)2D de DiaSorin
Tubo
CPM
duplicado
Promedio
CPM
CPM
corregido
Porcentaje
unión (B/T)
Porcentaje
(B/B0)
Conc.
(pg/mL)
Cuentas totales 40.792 40.685
40.578
NSB 1.438 1.439 3,5
1.439
Calibrador 0 18.006 18.063 16.624 44,4 100,0
18.119
Calibradores
(pg/mL)
1 (5,0) 16.710 16.740 15.302 92,0
16.770
2 (15,0) 14.941 14.929 13.490 81,2
14.916
3 (30,0) 13.087 13.106 11.667 70,2
13.124
4 (75,0) 9.820 9.793 8.354 50,2
9.765
5 (200) 6.412 6.438 5.000 30,0
6.464
Controles
Nivel 1: 13.275 13.403 11.964 72,0 27,3
rango normal 13.530
Nivel 2: 8.206 8.165 6.727 40,5 119
rango alto: 8.124
64
Curva de calibrador de muestra de ensayo RIA 1,25-(OH)2D RIA de DiaSorin
FIGURA 1
REDUCCIÓN DE DATOS
El laboratorio de control de calidad de DiaSorin utiliza un ajuste de línea estriada
alisada.
17. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
17.1 La frecuencia de las cuentas debería bastar para evitar errores debido a
ineficacia del contador (por ejemplo, la acumulación de 2.000 CPM dará como
resultado un error del 5%, 10.000 CPM dará como resultado un error del 1%).
17.2 Los resultados del ensayo deben utilizarse en combinación con otros datos
clínicos y de laboratorio para ayudar al médico a decidir el tratamiento
adecuado para cada paciente.
17.3 No se han establecido las características del desempeño de este ensayo en
poblaciones pediátricas.
18. VALORES PREVISTOS
Intervalo de referencia para donantes normales
Es importante que cada laboratorio establezca su propio intervalo de referencia con
respecto a la población a la que atiende. No obstante, se recogieron valores de
1,25-(OH)2D de 123 voluntarios aparentemente sanos en tres ciudades de la región
central de EE.UU. en unos exámenes clínicos realizados en tres lugares durante los
meses de verano y otoño. Estos 123 donantes sanos se componían de 37 hombres y
86 mujeres de diferentes razas con edades comprendidas entre los 21 y los 68 años.
La media del valor de 1,25-(OH)2D de la muestra total (n=123) fue de 43,9 pg/mL.
El intervalo de referencia de 95% estimado con un método no paramétrico (siguiendo
la directriz C28-A2 de CLSI15) fue 25,1-66,1 pg/mL.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 10 100 1000
pg/mL
% B/Bo
65
Pacientes con enfermedad renal en estado terminal
Se realizó un estudio para evaluar los niveles de 1,25-(OH)2D que se encontrarían en
una población adulta diagnosticada con enfermedad renal en estado terminal.
Se recogieron y sometieron a ensayo muestras de un total de 87 voluntarios
(49 hombres, 38 mujeres con edades comprendidas entre 19 y 84 años) de tres
ciudades de la región central de EE.UU. El rango observado de valores de 1,25-
(OH)2D para esta muestra (n=87) fue de 1,6-17,3 pg/mL. El límite de referencia
superior de 95% estimado en el procedimiento no paramétrico es de 14,2 pg/mL.
19. CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO ESPECÍFICAS
19.1 Precisión
DiaSorin evaluó la precisión del ensayo sobre la base de la directriz de CLSI (EP5-
A).16 Se realizaron ensayos sobre tres niveles de control basados en suero humano
con concentraciones de 1,25-(OH)2-D distribuidos en todo el rango del ensayo en
25 días de ensayo a lo largo de 60 días de trabajo. Se incluyeron numerosos técnicos,
así como numerosos números de lote para todos los componentes. Los resultados
combinados se evaluaron según análisis de variación (ANOVA) y se resumen en la
tabla siguiente.
Intraensayo Entre día Total
Muestra N
Media
pg/mL S.D. % CV S.D. % CV S.D. % CV
BAJA 25 25,8 1,76 6,8 3,8 14,6 4,0 15,3
MEDIA 25 41,3 3,16 7,7 4,6 11,1 5,1 12,3
ALTA 25 105,2 11,86 11,3 11,8 11,2 14,4 13,7
66
19.2 VERACIDAD: LA VERACIDAD DEL ENSAYO SE COMPROBÓ CON LA
PRUEBA DE LINEALIDAD Y DE RECUPERACIÓN.
Linealidad (paralelismo)
DiaSorin evaluó la linealidad de disolución de forma consistente con las
recomendaciones de la directriz EP6-P de CLSI.17 Se prepararon tres mezclas de
muestras de suero de pacientes mediante disolución en serie con calibrador cero y se
congelaron alícuotas de forma individual a –20°C. Cada muestra y disolución se
sometió a ensayo en múltiples réplicas en tres días diferentes. Los valores previstos
se determinaron con los valores no diluidos de cada mezcla de muestras multiplicados
por el factor de dilución. Los datos se resumen a continuación y los resultados
compuestos se trazan como una regresión lineal de valores previstos frente a valores
observados.
Muestra nº Dilución
Valor Previsto
(pg/mL) (N=10)
Valor Medio
Observado (pg/mL)
(N=10)
NO DILUIDA 49,6 49,6
1:2 24,8 25,3
1:4 12,4 11,1
1
1:8 6,2 4,4
NO DILUIDA 50,2 50,2
1:2 25,1 24,2
1:4 12,6 12,2
2
1:8 6,3 4,6
NO DILUIDA 62,0 62,0
1:2 31 31,9
1:4 15,5 13,4
3
1:8 7,8 6,2
RECUPERACIÓN
La capacidad del ensayo de recuperar cuantitativamente todo el analizado presente en
las muestras clínicas se evaluó mediante la adición de diferentes cantidades de
antígeno de 1,25-(OH)2-D puro recién preparado a tres mezclas de muestras de
pacientes. Se seleccionaron y sometieron a ensayo tres concentraciones y se
determinó el porcentaje de recuperación. El porcentaje medio de recuperación con
este método fue del 101%.
Muestra
nº
Conc. inic.
(pg/mL)
1,0 mL
Cantidad
introducida
(pg)
*Prevista
(pg/mL)
Observada
(pg/mL)
%
recuperación
50,0 77,7 75,6 97
1 30,8 62,5 88,9 87,2 98
75,0 99,8 103 103
50,0 89,2 89,5 100
2 42,8 62,5 100,3 98,9 99
75,0 111,0 118 106
50,0 86,8 83,9 97
3 40,3 62,5 97,9 103 105
75,0 108,8 118 108
*El cálculo de la concentración prevista incluye el factor de dilución introducido por la
solución añadida.
67
19.3 Sensibilidad analítica
La sensibilidad de este ensayo, definida como la cantidad más baja diferenciada de
cero con 2 desviaciones de calibrador por debajo del promedio de CPM del calibrador
0 (n = 20), ha demostrado ser <2,0 pg/mL.
19.4 Especificidad analítica
Los datos sobre reactividad cruzada del antisuero utilizado en este equipo se
expresan como la relación entre la concentración de 1,25-(OH)2D3 y la concentración
de la sustancia que presenta reactividad cruzada con una inhibición del 50% de unión
máxima.
Analizado Conc. a 50% B/Bo % reactividad cruzada
24,25 D3 76.420 pg/mL <0,5
25,26 D3 24.330 pg/mL <0,5
25 D3 >>>1 mg/mL <0,5
19.5 SUSTANCIAS QUE INTERFIEREN
Se realizó un estudio de interferencias para determinar si un nivel elevado de
endógenos comunes pueden afectar negativamente a los resultados del ensayo. La
evaluación era coherente con las directrices de CLSI (EP7-P).18 Se probaron tres
muestras basadas en suero humano con nivel bajo, medio y alto de 1,25-(OH)2-D3 con
adición de la sustancia en prueba o como controles, añadiendo volúmenes idénticos
del vehículo de la sustancia de prueba. Se realizaron dos extracciones de cada
muestra lo que generó cuatro réplicas. Los resultados presentados a continuación
demuestran que ninguna de las sustancias probadas produjo interferencias, como se
determinó en las pruebas estadísticas de ANOVA (intervalo de confianza de 95%), o
por el valor medio de las muestras añadidas que sobrepasan los rangos de desviación
de calibrador en ± 2 halladas para los controles.
Bilirrubina
Muestra nº
Media de
control
(pg/mL)
Rango de
control 2 SD
Media
bilirrubina
(pg/mL)
Interferencia
ANOVA
Baja 19,9 18,5-21,3 19,5 0,54
Media 31,7 27,7-35,7 29,9 0,22
Alta 79,7 63,5-95,9 83,2 0,45
Colesterol
Muestra nº
Media de
control
(pg/mL)
Rango de
control 2 SD
Media de
colesterol
(pg/mL)
Interferencia
ANOVA
Baja 19,9 18,5-21,3 19,4 0,64
Media 31,7 27,7-35,7 29,7 0,15
Alta 79,7 63,5-95,9 75,2 0,40
68
Triglicéridos
Muestra nº
Media de
control
(pg/mL)
Rango de
control 2 SD
Media de
triglicéridos
(pg/mL)
Interferencia
ANOVA
Baja 14,7 12,9-16,5 15,1 0,88
Media 30,4 22,4-38,4 33,4 0,25
Alta 92,6 69,5-116,9 95,4 0,68
Hemoglobina
Muestra nº
Media de
control
(pg/mL)
Rango de
control 2 SD
Media de
hemoglobin
a (pg/mL)
Interferencia
ANOVA
Baja 21,5 17,5-25,5 20,8 0,53
Media 38,6 35,4-41,8 40,0 0,43
Alta 112,7 101,4-124,0 120,6 0,17
Urea
Muestra nº
Media de
control
(pg/mL)
Rango de
control 2 SD
Media de
urea
(pg/mL)
Interferencia
ANOVA
Baja 25,1 20,9-29,3 26,6 0,39
Media 36,2 23,8-48,6 35,9 0,96
Alta 120,1 97,4-142,8 118,6 0,82
CONSULTE LA BIBLIOGRAFÍA EN LA ÚLTIMA PÁGINA.
69
PROGRAMA DEL ENSAYO
1. Los calibradores, controles y desconocidos se reconstituyen con etanol 95% y
trazador tras el paso de secado del procedimiento de columna.
2. Suministre los reactivos según el siguiente programa:
Tubos/Reactivos
Cuentas
totales NSB CAL
0-5
Controles y
muestras
desconocidas
Calibradores reconstituidos - - 75 μL -
Controles y muestras
desconocidas reconstituidos - - - 75 μL
Etanol 95% y trazador ** 75 μL 75 μL - -
Tampón NSB - 300 μL - -
Antisuero1,25-(OH)2-D - - 300 μL 300 μL
NOTA: Los tubos de cuentas totales y NSB se crean mediante la adición de 50 μL de
etanol 95% con 125 μL de trazador y la dosificación de 75 μL de esta mezcla en tubos
de ensayo duplicados.
3. Mezcle bien; incube durante 2 horas (+/- 15 minutos) a 20-25°C.
4. Suministre 500 μL de reactivo de precipitación GAR en todos los tubos salvo en
los de cuentas totales.
5. Mezcle bien; incube durante 20 minutos (+/- 5 minutos) a 20-25°C.
6. Centrifugue con 1800 x g* durante 20 minutos a 20-25°C.
7. Decante los sobrenadantes.
8. Cuente cada tubo en un contador gamma durante 1 minuto.
*g = (1118 x 10-8) (radio en cm) (rpm)2
70
KIT 125I RIA 1,25-DIIDROSSIVITAMINA D
1. USO PREVISTO
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.
Il kit 125I RIA 1,25-Diidrossivitamina D per l'analisi radioimmunologica ad equilibrio
competitivo serve per la determinazione quantitativa di 1,25-diidrossivitamina D (1,25-
(OH)2-D) nel siero umano o plasma EDTA, nonché per la valutazione della carenza di
1,25-(OH)2-D nei casi di affezioni renali. I risultati delle analisi, unitamente ad altri dati
clinici e di laboratorio, serviranno al medico specialista per prendere decisioni per la
scelta terapeutica del singolo paziente, facente parte di una popolazione adulta.
2. SOMMARIO E SPIEGAZIONI
La vitamina D deriva da due fonti: fonte esogena (dietetica) e fonte endogena
(biosintesi, regolata dall'esposizione alla luce ultravioletta). La fonte esogena, o
nutritiva, comprende cibi contenenti per loro natura bassi livelli di vitamina D2
(ad esempio, latte, burro, cereali arricchiti di D2 ), supplementi nutrizionali sotto forma di
vitamine da banco e formulazioni terapeutiche delle vitamine D2
1 La vitamina D non è
di per sé attiva quando entra in circolazione per vie dietetiche o fotochimiche. L'attività
biologica è attivata da una serie complessa di fasi metaboliche.2
È noto che l'attivazione metabolica della vitamina D è un processo complesso,
soggetto ad un'alterazione estensiva dovuta a variabili quali la presenza di calcio e
fosforo nella dieta, il livello di carenza di vitamina D, deficienze di natura genetica,
concentrazioni dell'ormone paratiroideo, esposizione alla luce ultravioletta e livello della
funzione renale.3 La biosintesi delle forme diidrossilate della vitamina D3 inizia con
l'azione della luce ultravioletta su 7-deidrocolesterolo per la formazione della vitamina
D3 nella pelle. Quando la vitamina D3 entra in circolazione, essa viene rapidamente
assorbita dal fegato dove viene metabolizzata in 25-idrossivitamina D3 (25-OH-D3).
Nel fegato, inoltre, avviene l'idrossilasi della vitamina D2 ricavata dal cibo in 25-
idrossivitamina D2 (25-OH-D2).2,4
Successivamente all'idrossilazione epatica, 25-OH-D viene trasportato assieme alla
proteina di legame della vitamina D nei reni dove avviene una successiva azione di
idrossilazione. L'aggiunta di un idrossile nella posizione 1 produce 1,25-diidrossivitamina
D (1,25-(OH)2-D). La 1,25-diidrossivitamina D è il metabolita naturale più potente finora
scoperto, e la sua produzione è strettamente regolata da concentrazioni di calcio in siero,
fosforo e dall'ormone paratiroideo. In periodi di deficienza di calcio, 1,25-(OH)2-D è il
metabolita di vitamina D più importante prodotto dai reni.5,6
Ciò è dovuto al suo ruolo essenziale di assorbimento attivo ed efficace di calcio e
fosforo, nonché al normale metabolismo di queste sostanze. Perciò, la misurazione di
1,25-(OH)2-D si sta affermando come uno strumento efficace per l'individuazione di
malattie e condizioni che interessano il normale metabolismo di fosforo e calcio.7,8,9
3. PRINCIPIO DELL'ANALISI
L'analisi DiaSorin 1,25-(OH)2-D prevede una procedura a due fasi. È prevista una
estrazione preliminare e successiva purificazione dei metaboliti della vitamina D dal
siero o dal plasma EDTA mediante l'impiego di cartucce C18OH.10 Dopo l'estrazione, il
campione trattato viene analizzato usando una procedura RIA competitiva. Il metodo
RIA si basa su un anticorpo policlonale che è specifico sia per 1,25-(OH)2 D2 sia per
1,25-(OH)2D3. Il campione, l'anticorpo e il tracciante vengono incubati per due ore alla
temperatura di 20 - 25°C. La separazione di fase avviene dopo un'incubazione di
20 minuti a 20 - 25°C mediante un secondo complesso precipitante gli anticorpi. Dopo
la centrifugazione e la decantazione, la frazione legata che rimane nel precipitato viene
misurata con un contatore a raggi gamma. I valori sono calcolati direttamente con una
curva di calibrazione di concentrazioni note. La concentrazione finale di 1,25-(OH)2D
nei campioni di siero e plasma EDTA è espressa in pg/mL.
71
4. REAGENTI FORNITI CON IL KIT
TAMPONE NSB 1,25-(OH)2D 1 fiala/3 mL
CALIBRATORE O 1,25-(OH)2D 1 fiala/20 mL
CALIBRATORI 1-5 1,25-(OH)2D3 5 fiale/3 mL
ANTISIERO 1,25-(OH)2D 1 flacone/35 mL
125 I 1,25-(OH)2D3 1 fiala/10 mL
SOLUZIONE PRETRATTANTE 1,25-(OH)2D3
1 flacone/50 mL
COMPLESSO PRECIPITANTE 1,25-(OH)2D GAR 2 fiale/35 mL
SIERO DI CONTROLLO 1,25-(OH)2D 2 fiale/3 mL
ETANOLO AL 95% 1 fiala/7 mL
Numero di test 100
CONSERVAZIONE: Il kit deve essere conservato a 2-8°C. Dopo l'apertura, conservare
ogni reagente a 2-8°C fino alla data di scadenza indicata sull'etichetta. I reagenti non
devono essere utilizzati dopo la data di scadenza. La data di scadenza del kit è
indicata sull'etichetta esterna e si riferisce alla data di scadenza del tracciante.
Durante la ricostituzione del contenuto delle fiale, mescolare delicatamente al fine di
evitare la formazione di schiuma. Conservare tutti i reagenti ricostituiti a -15°C o a
temperatura inferiore immediatamente dopo l'uso. Non si devono mescolare reagente
di lotti diversi.
4.1 Tampone NSB 1,25-(OH)2D: Reagente pronto all'uso
Tampone gelatina-potassio fosfato contenente ProClin 300 (< 0,2%).
4.2 Calibratore 0 1,25-(OH)2D: Reagente pronto all'uso
Tampone fosfato contenente proteine di siero bovino e ProClin 300 (< 0,2%).
4.3 Calibratori (1-5) 1,25-(OH)2D3: Reagente liofilizzato
Cinque calibratori liofilizzati (1,25-(OH)2D3) a concentrazioni varianti fra 5 - 200 pg/mL
contenenti siero umano e ProClin 300 (<0,2%). Ricostituire ogni calibratore con 3,0 mL
di calibratore zero. Le concentrazioni esatte sono indicate sulle etichette delle fiale. I
calibratori di questo kit sono calibrati mediante determinazione quantitativa UV. I
calibratori del kit dimostrano commutabilità con i campioni del paziente quando usati
con reagenti e con la procedura operativa di questo test diagnostico in vitro, come
consigliato.
4.4 Antisiero 1,25-(OH)2D: Reagente pronto all'uso
Siero di coniglio anti-1,25-(OH)2D diluito in un tampone gelatina-fosfato contenente
ProClin 300 (<0,2%).
4.5 125I 1,25-(OH)2D3 Reagente pronto all'uso
Analogo radio-iodato 1,25-(OH)2D3 diluito in un tampone fosfato-glicole etilenico.
4.6 Soluzione pretrattante 1,25-(OH)2D3: Reagente pronto all'uso
Tampone potassio fosfato.
72
4.7 Controlli 1,25-(OH)2D: Livello 1 (Normale), Livello 2 (Elevato): Reagente pronto
all'uso
Pool di siero umano elaborato, contenente ProClin 300 (<0,2%), a cui sono state
aggiunte le quantità necessarie di 1,25-(OH)2D per ottenere concentrazioni di controllo
nei range specificati. Il Controllo 1 indica un range normale, mentre il Controllo 2 indica
un range elevato. Il range delle concentrazioni di ogni controllo è riportato sul
certificato di analisi ed indica i limiti stabiliti da DiaSorin per i valori di controllo ottenibili
in sessioni di analisi affidabili.
4.8 Complesso precipitante GAR (Goat Anti-Rabbit, Capra Anti-coniglio):
Reagente liofilizzato
Il normale siero di coniglio, pre-precipitato con siero di capra anti-coniglio e glicole
polietilenico (PEG), è diluito in un tampone BSA-borato con 0,1% sodio azide ed altri
conservanti aggiunti (liofilizzati). Ricostituire la fiala con 35 mL di acqua distillata o
deionizzata; agitare bene fino a quando la sospensione si presenta omogenea e lasciare
riposare per almeno 30 minuti a temperatura ambiente agitando di tanto in tanto.
4.9 Etanolo al 95%: Reagente pronto all'uso
95% di etanolo e 5% di acqua.
NOTA: Per questa procedura è necessario anche l'uso delle cartucce C18OH. Le
cartucce devono essere ordinate separatamente alla DiaSorin facendo
riferimento al numero di catalogo 65101E.
5. AVVERTENZE E PRECAUZIONI
PER USO DIAGNOSTICO IN VITRO.
Non per uso interno o esterno su animali o persone.
ATTENZIONE: Il presente dispositivo deve essere consegnato, acquisito, conservato e
usato unicamente da personale medico, laboratori clinici, ospedali o istituti di ricerca. I
test devono essere eseguiti unicamente da personale di laboratorio qualificato e
adeguatamente addestrato.
REAGENTI CONTENENTI MATERIALE DI PROVENIENZA UMANA
Trattare come potenzialmente infettivi.
Ogni unità di siero/plasma da donatore usata nella preparazione di questo prodotto è
stata testata con una metodica approvata dalla FDA statunitense e trovata non reattiva
per la presenza di HBsAg, anticorpi ad HCV ed anticorpi ad HIV 1/2. Anche se questi
metodi sono estremamente accurati, non è garantita la localizzazione di tutte le unità
infette. Questo prodotto può inoltre contenere altro materiale di provenienza umana per
il quale non esiste un test approvato. Poiché nessuna metodologia di test approvata
può offrire garanzia completa sull'assenza del virus dell'epatite B (HBV), dell'epatite C
(HCV), del virus di immunodeficienza (HIV) o di altri agenti infettivi, tutto il materiale di
provenienza umana deve essere trattato in conformità con le buone pratiche di
laboratorio adottando le precauzioni appropriate come descritto nei manuale dei
Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health Manual,
"Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories," quarta edizione, Maggio
1999 o edizione corrente.
REAGENTI CONTENENTI SODIO AZIDE
ATTENZIONE: Alcuni reagenti di questo kit contengono sodio azide. La sodio azide
può reagire con componenti in piombo o rame e formare quindi azidi metalliche
altamente esplosive. Al momento dello smaltimento, lavare con abbondante acqua al
fine di evitare la formazione di azide. Per ulteriori informazioni, consultare
"Decontamination of Laboratory Sink Drains to Remove Azide Salts," nel manuale
Guide-Safety Management No. CDC-22 pubblicato dai Centri per il controllo e la
prevenzione delle malattie di Atlanta, GA, U.S. 1976.
73
Frasi di rischio per sostanze pericolose della Comunità Europea (Direttiva del
Consiglio 1999/45/CE)
R 20/21/22 - Harmful by inhalation, in contact with skin and if swallowed (Dannoso per
inalazione, per contatto con la pelle ed ingestione).
R 32 - Contact with acids liberates very toxic gas (Il contatto con acidi libera gas
altamente tossico).
S28 - After contact with skin, wash immediay with plenty of water (Dopo il contatto
con la pelle, lavare immediatamente con abbondante acqua).
REAGENTI CONTENENTI ETANOLO
Frasi di rischio per sostanze pericolose della Comunità Europea (Direttiva del
Consiglio 1999/45/CE)
R11 - Highly Flammable (altamente infiammabile)
S16 - Keep away from sources of ignition - No smoking (Tenere lontano da fonti di
ignizione - Non fumare).
S43 - In case of fire, use dry chemical or carbon dioxide (In caso di incendio, usare
agenti chimici essiccati o anidride carbonica).
REAGENTI CONTENENTI IODIO-125
Questo kit contiene materiale radioattivo che non supera 5,5 μCi (204kBq) di iodio-125.
Adottare precauzioni adeguate e le buone pratiche di laboratorio per la conservazione,
la manipolazione e lo smaltimento di questo materiale.
Per i professionisti o gli istituti che utilizzano radioisotopi con una licenza generale:
Questo materiale radioattivo può essere consegnato, acquisito, conservato e usato
unicamente da personale medico, laboratori clinici o ospedali e unicamente per test in
vitro clinici o di laboratorio che non prevedano la somministrazione interna o esterna
del materiale, o di radiazioni da esso derivanti, su persone o animali. L'acquisto, il
possesso, la conservazione, l'uso e il trasferimento sono soggetti alle norme e alla
licenza generale della Nuclear Regulatory Commission statunitense dello stato con cui
la Commissione ha stipulato un accordo per l'esercizio dell'autorità normativa.
1. La conservazione del materiale radioattivo deve essere limitata ad un'area
specificatamente designata.
2. L'accesso ai materiali radioattivi deve essere limitato esclusivamente al personale
autorizzato.
3. Non usare la bocca per versare con la pipetta materiale radioattivo.
4. Non mangiare o bere nelle aree di lavoro designate per materiale radioattivo.
5. Le zone dove possono verificarsi perdite devono essere pulite, quindi lavate con
detergente alcalino o soluzione per la decontaminazione radiologica. Tutti gli
oggetti in vetro usati devono essere accuratamente risciacquati con acqua prima di
lavarli con altri oggetti in vetro del laboratorio.
Per i professionisti o gli istituti che utilizzano radioisotopi con una licenza specifica:
L'acquisto, l'uso, il trasferimento e lo smaltimento di materiali radioattivi sono soggetti
alle norme e alle condizioni della licenza specifica.
AVVERTENZA: Questo prodotto contiene un prodotto chimico noto nello Stato della
California per provocare cancro.
ATTENZIONE: La radioattività stampata sulle istruzioni allegate alla confezione può
essere leggermente diversa dalla radioattività stampata sull'etichetta della scatola e
sull'etichetta della fiala di tracciante. L'etichetta sulla scatola e sulla fiala di tracciante
indicano la quantità effettiva di radioattività alla data di calibrazione, mentre il materiale
informativo della confezione indica la radioattività teorica del kit.
74
6. INDICAZIONI DI POSSIBILE DETERIORAMENTO DEI REAGENTI DEL KIT
6.1 La presenza di particolato anomalo in uno qualsiasi dei reagenti.
6.2 Uno sfasamento nella pendenza o posizione della curva di calibrazione
rispetto a quella che normalmente si ottiene.
6.3 Una diminuzione del legame massimo.
6.4 Un legame altamente non specifico.
7. PRELIEVO E PREPARAZIONE DEL SIERO E DEL PLASMA
Per l'utilizzo del kit 1,25-Diidrossivitamina D sono richiesti 500 μL di siero o plasma
EDTA per eseguire l'estrazione; un volume di 1,5 mL consentirà di ripetere le analisi e
di fornire un volume adeguato per le operazioni con la pipetta.
Con questo kit si può usare siero o plasma umano. Per questa analisi si può usare
anticoagulante EDTA. Si consigliano campioni prelevati a digiuno, anche se non
obbligatorio. Il sangue deve essere prelevato in maniera asettica mediante
venopuntura in una provetta di vetro da 5 o 10 mL sotto vuoto. Per il siero, lasciar
coagulare il sangue a temperatura ambiente (15-25°C). Centrifugare per 15 minuti
usando circa 760 x g* per ottenere sieri privi di emolisi. Non sono richiesti additivi o
conservanti per mantenere l'integrità del campione. Tutto il materiale in plastica, oggetti
in vetro o altro materiale che viene a contatto con i campioni deve essere
completamente esente da qualsiasi contaminazione.
Conservare i campioni di siero o plasma a -15°C o a temperatura inferiore. I campioni
non devono essere congelati e scongelati più volte. Tuttavia, uno studio eseguito da
DiaSorin non ha indicato alcun cambiamento significativo nei valori dopo 3 cicli di
congelamento-scongelamento dei campioni. I campioni sono stati conservati per un
periodo di 6 mesi a -15°C o temperature inferiori senza presentare cambiamenti
significativi nei risultati.
8. ATTREZZATURE E MATERIALI NECESSARI, NON FORNITI IN DOTAZIONE
8.1 Cartucce C18OH (24 cartucce) ordinabili separatamente con riferimento al
numero di catalogo 65101E.
8.2 Provette in vetro borosilicato monouso, 12 x 75 mm e 13 x 100 mm.
8.3 Portaprovette.
8.4 Pellicola o equivalente per coprire le provette.
8.5 Portaprovette con alloggiamento in schiuma per la decantazione (o materiale
equivalente).
8.6 Centrifuga in grado di contenere 12 provette da 75 mm e raggiungere
1800 x g*.
8.7 Contatore a raggi gamma in grado di contare 125I.
8.8 Mixer Vortex.
8.9 Dispositivi per operazioni con pipetta:
a. Micropipette dosatrici calibrate per inviare 75 μL, 300 μL e 500 μL.
b. Dosatori a ripetizione in grado di inviare 50 μL, 300 μL e 500 μL.
c. Pipette volumetriche per la ricostituzione dei calibratori, 3,0 mL.
8.10 Acqua distillata o deionizzata.
*g = (1118 x 10-8 ) (raggio in cm) (rpm)2
75
8.11 Solventi organici:
Sono richiesti i seguenti solventi per la preparazione e l'estrazione dei
campioni.
Usare solo solventi di grado HPLC.
Non esporre nessun solvente organico ad oggetti in vetro lavati in acidi o a
qualsiasi altra condizione acida.
a. Acetonitrile.
b. Metanolo.
c. Esano. (IMPORTANTE: la percentuale di n-esano deve essere superiore
del 95%)
d. Cloruro di metilene (non deve contenere alcool come conservante).
e. Isopropanolo (2-propanolo).
8.12 Dispositivo consigliato per le cartucce C18OH:
a. Stazione di trattamento dei campioni Vac Elut. Tratta 24 colonne per
analisi. Disponibile presso Analytichem International o DiaSorin. Per
ordinare da DiaSorin, indicare il numero di catalogo 11610.
8.13 Materiali necessari per asciugare i campioni:
a. Azoto.
b. Collettore essiccante completo di blocco riscaldante a 37°C (±2°C) o
bagno di acqua:
N-EVAP o MULTI-VAP disponibile presso Organomation Associates
(Berlin, MA) o Reacti-Vap II e Reacti-Therm III disponibile presso Pierce
Chemical Company (Rockford, IL).
9. PREPARAZIONE DEI SOLVENTI ORGANICI PER L'ESTRAZIONE IN
COLONNA
NOTA: Le miscele di solventi organici devono essere preparate prima di iniziare
la procedura di estrazione preliminare.
PRECAUZIONI:
Preparare le miscele di solventi come descritto nella TABELLA I; DiaSorin consiglia la
preparazione di un volume di 500 mL. Si possono preparare volumi maggiori o inferiori
a condizione che le proporzioni siano costanti. I volumi, tuttavia, devono essere
sufficientemente abbondanti da ridurre l'errore di misurazione. Per ottenere i migliori
risultati, misurare ogni solvente separatamente.
PRECAUZIONI:
Dove richiesto, usare acqua distillata o deionizzata.
TABELLA I
Preparazione del solvente
Miscela di
solvente Materiali 1 L 500 mL
metanolo 700 mL 350 mL
70:30 acqua 300 mL 150 mL
esano 900 mL 450 mL
90:10 cloruro di metilene 100 mL 50 mL
esano 990 mL 495 mL
99:1 IPA 10 mL 5 mL
esano 920 mL 460 mL
92:8 IPA 80 mL 40 mL
76
10. PROCEDURA DI ESTRAZIONE PRELIMINARE
10.1 Ricostituire ogni calibratore liofilizzato con 3,0 mL di calibratore zero.
Mescolare bene i calibratori e lasciar riposare per 15 - 20 minuti per garantire
la completa ricostituzione. Scongelare completamente eventuali reagenti
congelati. Lasciare che tutti i reagenti raggiungano la temperatura ambiente.
Evitare che i reagenti raggiungano temperature superiori a 25°C. Mescolare
bene tutti i reagenti prima dell'uso.
10.2 Iniettare con pipetta 500 μL di calibratore (0-5), controllo e campione in
12 provette da 75 mm in vetro borosilicato etichettate.
10.3 Aggiungere 500 μL di acetonitrile in ogni campione; agitare ad intermittenza
nel Vortex, almeno 3 volte, per un tempo di 10 minuti.
10.4 Centrifugare le provette a 760 x g* per 10 minuti a 20 - 25°C.
10.5 Far decantare i liquidi superficiali del campione in 12 provette etichettate da
75 mm o 13 provette da 100 mm (a seconda delle preferenze); scartare i
precipitati.
10.6 Aggiungere 500 μL di soluzione pretrattante in ogni provetta e agitare nel
Vortex.
NOTA: Questo kit serve per eseguire fino a 48 estrazioni complete con
calibratori e controlli, più 40 campioni non noti. Ciò significa che si possono
estrarre 24 campioni immediatamente su VacElut e la serie rimanente di
24 campioni può essere estratta successivamente. Le estrazioni in colonna
devono essere eseguite al più presto possibile dopo l'aggiunta del
pretrattante. Tuttavia, una volta estratti in colonna, i campioni possono essere
conservati per 96 ore a -15°C o a temperatura inferiore.
10.7 I campioni sono pronti per essere versati nelle cartucce C18OH.
11. PROCEDURA PER LA COLONNA
11.1 Per una descrizione del VAC ELUT, consultare la relativa Guida per l'utente.
Montare la stazione come da istruzioni.
11.2 Etichettare 13 provette in vetro borisilicato da 100 mm per ogni calibratore
(0-5), controllo e campione non noto. Inserire le provette nel VAC ELUT.
Controllare che il coperchio del VAC ELUT sia in posizione "WASTE" e che le
provette siano disposte in modo da raccogliere gli eluati richiesti. Porre le
cartucce C18OH sul coperchio del VAC ELUT.
11.3 Aggiungere le miscele di solvente alle cartucce specifiche come descritto nella
TABELLA II.
IMPORTANTE:
Uso del vuoto:
Azionare il vuoto dopo ogni aggiunta di solvente e lasciare che la miscela del
solvente passi completamente nella cartuccia prima di trattare il solvente
successivo. Azionare e spegnere il vuoto seguendo le indicazioni date nella
TABELLA II (è possibile spegnere il vuoto prima di aggiungere ogni solvente).
Il vuoto deve essere regolato a 10 pollici (254 mm di Hg) o a un valore inferiore.
Eluire ogni miscela di solvente attraverso l'apertura "WASTE" e nei relativi
contenitori per rifiuti fino a giungere alla fase finale di raccolta.
*g = (1118 x 10-8 ) (raggio in cm) (rpm)2
77
Applicazione dei campioni:
I campioni possono essere fatti decantare direttamente nella cartuccia o iniettati
con una pipetta.
Non permettere che le cartucce si asciughino all'aria per più di 5 minuti fra le
applicazioni.
Pretrattamento della cartuccia C18OH:
Le cartucce C18OH devono essere lavate con 5 mL di 90:10 (esano: cloruro di
metilene), 5 mL di IPA e 5 mL di metanolo prima del primo utilizzo. La miscela di
solvente 90:10 (esano: cloruro di metilene) può essere preparata misurando
900 mL di esano e 100 mL di cloruro di metilene. Inserire le nuove cartucce
intatte nel dispositivo VAC ELUT, regolare sulla posizione "WASTE" ed
aggiungere 5 mL di 90:10 (esano: cloruro di metilene) e quindi 5 mL di IPA in ogni
colonna, infine 5 mL di metanolo. Lasciare che ogni miscela di solvente passi
completamente attraverso le cartucce prima di procedere con la miscela
successiva. Dopo questa preparazione iniziale, non sarà più necessario ripetere
questa operazione in quanto le cartucce verranno rigenerate durante la procedura
di estrazione.
NOTA: Se si devono estrarre altri campioni (più di 24), rigenerare le cartucce
utilizzando lo stesso metodo descritto nella TABELLA II. Le cartucce possono
essere riutilizzate fino a 30 volte.
NOTA: Il materiale che compone la cartuccia C18OH è tenuto assieme da un
composto in fibra porosa. Scartare le cartucce con vetri porosi mal posizionati o
mancanti al fine di evitare la perdita di materiale C18OH.
78
TABELLA II
Descrizione dell'analisi di
estrazione
Fasi di estrazione Utilizzo dell'eluente
1. Aggiungere 1 mL di metanolo,
azionare il vuoto.
Preparazione/Rigenerazione
nella colonna Rimuove: sostanze
interferenti dall'utilizzo precedente
(fase 1) 2. Spegnere il vuoto.
Scartare
“WASTE”
Applicazione del campione
3. Applicare tutti i campioni,
azionare il vuoto. Vedere
procedura di estrazione
preliminare (fase 10).
Scartare
“WASTE”
Purificazione/Rimozione dei
metaboliti della vitamina D
4. Aggiungere 5 mL di 70:30
metanolo/acqua (deionizzata o
distillata).
Rimuove: Lipidi polari interferenti, sali
e pigmenti (fase 4)
5. Aggiungere 5 mL di 90:10
esano/cloruro di metilene.
25(OH)D (Fase 5) 6. Aggiungere 5 mL di 99:1
esano/isopropanolo.
25(OH)D e 24,25(OH)2 D/25,26(OH)2
D rimanente (fase 6)
7. Spegnere il vuoto.
Scartare
“WASTE”
Raccolta di 1,25-(OH)2 D IMPORTANTE!
Eluizione di 1,25-(OH)2 D purificato
(fase 9)
8. Azionare il Vac Elut per
"Collect:" (raccogliere)
9. Aggiungere 3 mL di 92:8
esano/isopropanolo e azionare
il vuoto.
10. Spegnere il vuoto.
“COLLECT”
12. ESSICCAZIONE E RICOSTITUZIONE DEGLI ELUATI
12.1 Disporre le provette contenenti gli eluati in un blocco riscaldante o in bagno di
acqua a 37°C (±2°C) per l'essiccazione.
12.2 Essiccare gli eluati sotto una cappa utilizzando azoto a 2-4 psi (tempo di
essiccazione 20-30 minuti).
12.3 Togliere le provette immediatamente dopo l'essiccazione degli eluati.
12.4 Ricostituire ogni estratto essiccato con 50 μL di etanolo al 95%; agitare nel
vortex a velocità bassa o media. Aggiungere 125 μL di tracciante nelle stesse
provette contenenti 50 μL di etanolo al 95%, agitare delicatamente nel vortex a
una velocità bassa o media. NOTA: Le operazioni con il vortex sono molto
importanti per garantire una adeguata ricostituzione dei campioni e per
ottenere una buona precisione. ATTENZIONE: Tenere il vortex nella parte più
bassa della provetta per evitare perdita di volume del campione che servirà a
garantire un volume sufficiente di prelievo con pipetta per l'analisi. Etichettare
una provetta supplementare per il Conteggio totale e una provetta per NSB.
Aggiungere 50 μL di etanolo al 95% e 125 μL di tracciante in entrambe le
provette. Queste provette verranno usate per ottenere il TC (Total Count,
Conteggio totale) e una seconda serie di provette NSB per la configurazione
dell'analisi.
79
12.5 Eseguire l'analisi immediatamente dopo la ricostituzione dei campioni. Per
ottenere i migliori risultati quando si eseguono analisi più estese, ricostituire 12
- 15 campioni alla volta e quindi iniettare con pipetta prima di ricostituire i 12 -
15 campioni successivi.
13. PROCEDURA DI ANALISI
13.1 Preparare ed etichettare due serie di 12 provette da 75 mm in vetro
borosilicato monouso per ogni calibratore (0-5), controllo e campione in base
allo schema di analisi. Con caua, aggiungere 75 μL il calibratore ricostituito,
controllo ed estratti di campione nella seconda serie di provette.
ATTENZIONE: Questa fase deve essere eseguita con caua, in quanto ci
sono solo 25 μL di eccedenza in ogni provetta.
13.2 Fare riferimento alla fase 4 di "Essiccazione e ricostituzione degli eluati".
Aggiungere 75 μL dalla provetta TC (Total Count, Conteggio totale) nella
seconda serie di provette. Ripetere questa operazione anche per la seconda
serie di provette NSB.
13.3 Aggiungere 300 μL di tampone NSB nelle provette NSB.
13.4 Aggiungere 300 μL di anticorpo primario in tutte le provette, eccetto per le
provette per i conteggi totali e NSB.
13.5 Mescolare bene; lasciare in incubazione per 2 ore (±15 minuti) a 20 - 25°C.
NOTA: Ricostituire il complesso precipitante GAR con 35 mL di acqua
distillata o deionizzata, mescolare completamente fino a quando la
sospensione si presenta omogenea, quindi lasciar riposare per almeno 30
minuti a temperatura ambiente prima dell'uso mescolando occasionalmente
prima e durante l'uso.
13.6 Aggiungere 500 μL di complesso precipitante GAR ben mescolato in tutte le
provette, eccetto le provette per il Conteggio totale. Lasciare in incubazione
per 20 minuti (±5 minuti) a 20 - 25°C.
13.7 Centrifugare tutte le provette per 20 minuti a 20 - 25°C a 1800 x g*, eccetto le
provette per il Conteggio totale.
13.8 Far decantare i liquidi superficiali, eccetto le provette per il Conteggio totale,
usando un portaprovette con alloggiamento in schiuma o materiale simile,
capovolgendo l'alloggiamento in un contenitore adeguato per i rifiuti. Porre
l'alloggiamento capovolto su carta assorbente per 2-3 minuti. Asciugare
delicatamente le provette per rimuovere tutto il liquido.
13.9 Misurare con un contatore a raggi gamma la radioattività contando tutte le
provette per 1 minuto. Le provette devono essere contate per almeno
1 minuto (vedere la sezione: Limiti della procedura).
14. COMMENTI ALLA PROCEDURA
14.1 Aggiungere ogni aliquota di reagente al terzo inferiore della provetta di analisi
al fine di garantire una miscela completa di reagenti.
14.2 Proporzioni corrette di solvente sono indispensabili per un buon recupero.
Preparare le soluzioni in volumi sufficientemente abbondanti in modo da
ridurre errori di misurazione.
14.3 Se un campione dà una lettura maggiore rispetto al calibratore superiore, il
campione dovrà essere analizzato nuovamente diluendolo con il calibratore 0
prima dell'estrazione. I risultati dovranno essere moltiplicati per il fattore di
diluizione appropriato. Ad esempio, mescolare 500 μL di campione con
500 μL di calibratore 0, quindi analizzare 500 μL della miscela come da
istruzioni allegate.
*g = (1118 x 10-8 ) (raggio in cm) (rpm)2
80
14.4 Non è stata osservata alcun drift nel tempo medio necessario per eseguire
l'analisi di 100 provette.
14.5 Per monitorare completamente la costanza e la validità di un'analisi RIA, si
possono controllare altri fattori. DiaSorin consiglia di controllare regolarmente i
seguenti parametri per garantire prestazioni costanti del kit.
a. Conteggi totali
b. Legame massimo
Conteggi medi al minuto (CPM) delle provette del calibratore 0/CPM
medio delle provette per il conteggio totale.
c. Legame non specifico
CPM medio delle provette NSB/CPM medio delle provette per il conteggio
totale.
d. Pendenza della curva di calibrazione
Si può monitorare la soppressione al 50%.
15. CONTROLLO DI QUALITA'
Ogni laboratorio dovrebbe includere almeno due controlli (uno a livello normale ed uno
a livello elevato) in ogni analisi per monitorare le performance. Si possono utilizzare i
controlli disponibili in commercio o i due controlli di riferimento forniti con il kit.
I controlli devono essere considerati come campioni non noti e analizzati in duplice
copia. Conservare le tabelle per il controllo della qualità al fine di verificare le
performance dei controlli. Limiti accettabili per le performance verranno stabiliti da ogni
singolo laboratorio per ogni livello di controllo utilizzando metodi basati su statistiche
ideati per rilevare errori sistematici e casuali. I risultati dei controlli devono
corrispondere ai criteri del laboratorio per quanto concerne l'accettabilità prima di
riferire i risultati dei test ai pazienti.12, 13, 14
16. CALCOLO DEI RISULTATI
Esistono molti metodi per calcolare i risultati di analisi RIA, ognuno tende ad ottenere
una curva di calibrazione mediante tracciamento dell'estensione del legame rispetto
alle concentrazioni indicate dei calibratori per la calibrazione. Il grafico può essere su
scala lineare o logaritmica. Ciascun metodo dà essenzialmente gli stessi valori per i
controlli e i campioni, anche se certe analisi possono essere più "adatte" per un
particolare metodo rispetto ad un altro. Il metodo di calcolo del Laboratorio di controllo
qualità di DiaSorin è % di B/B0 rispetto alla concentrazione logaritmica basata su un
programma di retta curvilinea uniforme.
16.1 Calcolo della percentuale B/B0
a. Calcolare il CPM medio per ogni calibratore, controllo e campione non
noto.
b. Sottrarre il CPM medio delle provette NSB da tutti i conteggi.
c. Dividere il CPM corretto di ogni calibratore, controllo o campione non noto
per il CPM medio corretto del calibratore 0 e moltiplicare per 100.
CPM medio (Calibratore o Campione non noto) - CPM medio (NSB)
CPM medio (Calibratore 0 ) -CPM medio (NSB)
x 100 = B/B0 (%)
16.2 Uso della curva del calibratore
a. Utilizzando carta millimetrata per modello log-logit o semi-logaritmica a
due cicli, tracciare la percentuale di B/B0 (%) per i calibratori 1,25 (OH)2D
sull'asse delle ordinate (asse Y) e la concentrazione del calibratore
sull'asse delle ascisse (asse X).
81
NOTA: Si possono usare programmi di riduzione automatica dei dati per
analizzare i dati. DiaSorin utilizza Multi-Calc (Pharmacia) con un
programma LIN-LOG a CURVA uniforme. Alti metodi di riduzione dei dati
devono essere convalidati prima di includerli nell'uso regolare.
b. Tracciare una linea di miglior interpolazione fra i punti.
c. Interpolare i livelli di 1,25-(OH)2D nei campioni dal tracciato dei calibratori.
d. Se è stato diluito un campione non noto, correggere con il fattore di
diluizione idoneo.
e. Il range riferibile dell'analisi è da 5,0 pg/mL a 200 pg/mL. Un valore
inferiore al calibratore più basso, 5,0 pg/mL, è un valore estrapolato e può
essere indicato come "less than 5 pg/mL" (inferiore a 5 pg/mL).
f. Calcolare il legame massimo dividendo il CPM del calibratore 0 per la
media dei conteggi totali ottenuta nelle provette dei conteggi totali.
I dati di campioni tipici per 1,25-(OH)2D RIA sono indicati nella TABELLA IV e nella
FIGURA 1; queste informazioni servono solo a scopo di riferimento e non devono
essere usate per il calcolo dei valori.
TABELLA IV
Dati campione DiaSorin 1,25-(OH)2D RIA
Provetta
Duplicato
CPM
Media
CPM
CPM
corretto
Percent.
Bound (B/T)
Percent.
(B/B0)
Conc.
(pg/mL)
Conteggio totale 40.792 40.685
40.578
NSB 1.438 1.439 3,5
1.439
Calibratore 0 18.006 18.063 16.624 44,4 100,0
18.119
Calibratori
(pg/mL)
1 (5,0) 16.710 16.740 15.302 92,0
16.770
2 (15,0) 14.941 14.929 13.490 81,2
14.916
3 (30,0) 13.087 13.106 11.667 70,2
13.124
4 (75,0) 9.820 9.793 8.354 50,2
9.765
5 (200) 6.412 6.438 5.000 30,0
6.464
Controlli
Livello 1: 13.275 13.403 11.964 72,0 27,3
range normale 13.530
Livello 2: 8.206 8.165 6.727 40,5 119
range elevato: 8.124
82
Curva campione di calibratore DiaSorin 1,25-(OH)2D RIA
FIGURA 1
RIDUZIONE DEI DATI
Il Laboratorio di controllo di qualità DiaSorin QC utilizza una retta curvilinea uniforme.
17. LIMITI DELLA PROCEDURA
17.1 Il conteggio delle volte dovrebbe essere sufficiente per prevenire l'introduzione
di un errore dovuto ad inaccuratezza del contatore (ad esempio, l'accumulo di
2.000 CPM produrrà un errore del 5%, 10.000 CPM produrrà un errore
dell'1%).
17.2 I risultati delle analisi devono essere usati unitamente ad altri dati clinici e di
laboratorio al fine di aiutare il medico specialista a prendere decisioni per la
scelta terapeutica del singolo paziente.
17.3 Le caratteristiche di efficacia di questa analisi non sono state studiate sulla
popolazione pediatrica.
18. VALORI PREVISTI
Intervallo di riferimento per donatori normali
È importante che ogni laboratorio stabilisca un intervallo di riferimento proprio,
rappresentativo della sua popolazione tipica. Tuttavia, sono stati raccolti valori di
1,25-(OH)2D sulla base di 123 volontari apparentemente sani di tre città centrooccidentali
degli Stati Uniti in un trial clinico condotto in tre siti nei mesi estivi e
autunnali. Questi 123 donatori sani erano composti da un gruppo di 37 uomini e 86
donne di razze diverse, di età media fra 21 e 68 anni. Il valore medio di 1,25-(OH)2D
dell'intero campione (n=123) è stato di 43,9 pg/mL. Il 95% dell'intervallo di riferimento
valutato con metodo non parametrico (in base alle linee guida CLSI C28-A215) è stato
di 25,1-66,1 pg/mL.
Pazienti con insufficienza renale allo stadio finale
È stato eseguito un trial clinico al fine di valutare i livelli di 1,25-(OH)2D che
normalmente si trovano in una popolazione adulta con diagnosi di insufficienza renale
allo stadio finale.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 10 100 1000
pg/mL
% B/Bo
83
Sono stati prelevati e analizzati campioni da un totale di 87 volontari (49 uomini,
38 donne, di età compresa fra 19 e 84anni) di tre città centro-occidentali degli Stati
Uniti. Il range osservato dei valori di 1,25-(OH)2D per questo campione (n=87) è stato
di 1,6-17,3 pg/mL. Il 95% del limite superiore di riferimento valutato con procedura non
parametrica è di 14,2 pg/mL.
19. CARATTERISTICHE SPECIFICHE DELLE PERFORMANCE
19.1 Precisione
La precisione delle analisi è stata valutata dalla DiaSorin sulla base dei principi delle
Linee guida CLSI (EP5-A).16 Sono stati analizzati tre livelli di controllo basati su siero
umano con concentrazioni di 1,25-(OH)2-D distribuiti nel range di analisi che
comprendono 25 analisi in oltre 60 giorni operativi. Per tutti i componenti hanno
operato più tecnici, e sono inoltre stati inclusi più numeri di lotto. I risultati combinati
sono stati valutati in base all'analisi della varianza (ANOVA) e riepilogati nella tabella
seguente.
In un ciclo di
analisi Fra giorni Totale
Campione N
pg/mL
medio D.S. % CV D.S. % CV D.S. % CV
BASSO 25 25,8 1,76 6,8 3,8 14,6 4,0 15,3
MEDIO 25 41,3 3,16 7,7 4,6 11,1 5,1 12,3
ALTO 25 105,2 11,86 11,3 11,8 11,2 14,4 13,7
19.2 ACCURATEZZA: L'ACCURATEZZA DELL'ANALISI È STATA CONTROLLATA
MEDIANTE TEST DI LINEARITÀ E TEST DI RECUPERO.
Linearità (Parallelismo)
La linearità di diluizione è stata considerata da DiaSorin coerente con le
raccomandazioni delle Linee guida CLSI, EP6-P.17 Sono stati preparati tre gruppi di
campioni di siero mediante diluizione seriale con calibratore 0 e parti sono state
congelate a –20°C. Ogni campione e ogni diluizione è stato analizzato più volte in tre
date diverse. I valori previsti sono stati stabiliti in base ai valori di ogni gruppo di
campioni non diluito moltiplicato per il fattore di diluizione. I dati sono riepilogati di
seguito e i risultati compositi tracciati sotto forma di regressione lineare di Valore
previsto rispetto a Valore osservato.
N. campione Diluizione
Valore Previsto
(pg/mL) (N=10)
Valore Medio
Osservato (pg/mL)
(N=10)
1 NON DILUITO 49,6 49,6
1:2 24,8 25,3
1:4 12,4 11,1
1:8 6,2 4,4
2 NON DILUITO 50,2 50,2
1:2 25,1 24,2
1:4 12,6 12,2
1:8 6,3 4,6
3 NON DILUITO 62,0 62,0
1:2 31 31,9
1:4 15,5 13,4
1:8 7,8 6,2
84
RECUPERO
La capacità di recuperare quantitativamente tutti gli analiti presenti nei campioni clinici
è stata valutata mediante aggiunta di quantità diverse di antigene puro 1,25-(OH)2-D
appena preparato in tre gruppi di campioni. Sono state scelte e analizzate in duplice
copia tre concentrazioni, quindi è stata stabilita la percentuale di recupero. La
percentuale media di recupero in base a questo metodo è stata di 101%.
N.
Campione
Conc. iniziale
(pg/mL)
1.0 mL
Quantità
aggiunta (pg)
*Previsto
(pg/mL)
Osservato
(pg/mL)
% di
recupero
1 50,0 77,7 75,6 97
30,8 62,5 88,9 87,2 98
75,0 99,8 103 103
2 50,0 89,2 89,5 100
42,8 62,5 100,3 98,9 99
75,0 111,0 118 106
3 50,0 86,8 83,9 97
40,3 62,5 97,9 103 105
75,0 108,8 118 108
*Il calcolo della concentrazione prevista comprende il fattore di diluizione introdotto
dalla soluzione che viene aggiunta.
19.3 Sensibilità analitica
La precisione di questa analisi, se definita come quantità minore differenziata da zero,
a 2 deviazioni del calibratore sotto il CPM medio del calibratore zero (n=20), si è
dimostrata essere <2.0 pg/mL.
19.4 Specificità analitica
I dati sulla reattività incrociata dell'antisiero utilizzato in questo kit sono espressi come
rapporto di concentrazione di 25-OH2D3 rispetto alla concentrazione della sostanza
reagente incrociata al 50% di inibizione del legame massimo.
Analita Conc. A 50% B/Bo % di reattività incrociata
24,25 D3 76.420 pg/mL <0,5
25,26 D3 24.330 pg/mL <0,5
25 D3 >>>1 mg/mL <0,5
19.5 Sostanze interferenti
È stato eseguito uno studio sull'interferenza per stabilire se livelli elevati di sostanze
endogene comuni possono influire negativamente sui risultati dell'analisi. La
valutazione si è basata sulle Linee guida CLSI (EP7-P).18 Sono stati testati tre campioni
di siero umano contenenti livelli bassi, medi o elevati di 1,25-(OH)2-D3 con aggiunta o
di una sostanza di prova o controllo a cui sono stati aggiunti volumi identici di una
sostanza veicolo di prova. Ogni campione è stato estratto due volte ottenendo così
quattro replicati. I risultati indicati di seguito dimostrano che non c'è stata alcuna
interferenza da parte di nessuna delle sostanze testate, come stabilito da prove
statistiche ANOVA (95% di intervallo di certezza), o dal valore medio dei campioni che
superava ± 2 intervalli di deviazione del calibratore trovati per i controlli.
85
Bilirubina
N.
campione
Media
controllo
(pg/mL)
Intervallo di
controllo di 2
dev. standard
Media
bilirubina
(pg/mL)
Interferenza
ANOVA
Basso 19,9 18,5-21,3 19,5 0,54
Medio 31,7 27,7-35,7 29,9 0,22
Alto 79,7 63,5-95,9 83,2 0,45
Colesterolo
N.
campione
Media
controllo
(pg/mL)
Intervallo di
controllo di 2
dev. standard
Media
colesterolo
(pg/mL)
Interferenza
ANOVA
Basso 19,9 18,5-21,3 19,4 0,64
Medio 31,7 27,7-35,7 29,7 0,15
Alto 79,7 63,5-95,9 75,2 0,40
Trigliceridi
N.
campione
Media
controllo
(pg/mL)
Intervallo di
controllo di 2
dev. standard
Media
trigliceridi
(pg/mL)
Interferenza
ANOVA
Basso 14,7 12,9-16,5 15,1 0,88
Medio 30,4 22,4-38,4 33,4 0,25
Alto 92,6 69,5-116,9 95,4 0,68
Emoglobina
N.
campione
Media
controllo
(pg/mL)
Intervallo di
controllo di 2
dev. standard
Media
emoglobina
(pg/mL)
Interferenza
ANOVA
Basso 21,5 17,5-25,5 20,8 0,53
Medio 38,6 35,4-41,8 40,0 0,43
Alto 112,7 101,4-124,0 120,6 0,17
Urea
N.
campione
Media
controllo
(pg/mL)
Intervallo di
controllo di 2
dev. standard
Media urea
(pg/mL)
Interferenza
ANOVA
Basso 25,1 20,9-29,3 26,6 0,39
Medio 36,2 23,8-48,6 35,9 0,96
Alto 120,1 97,4-142,8 118,6 0,82
FARE RIFERIMENTO ALL'ULTIMA PAGINA PER LA BIBLIOGRAFIA
86
SCHEMA DI ANALISI
1. I calibratori, i controlli e i campioni non noti vengono tutti ricostituiti con etanolo
al 95% e tracciante dopo la fase di essiccazione.
2. Versare il reagente seguendo lo schema seguente:
Provette/Reagenti
Conteggi
totali NSB CAL
0-5
Controlli e
campioni non noti
Calibratori ricostituiti - - 75 μL -
Controlli e campioni non noti
ricostituiti - - - 75 μL
Etanolo al 95% e
tracciante**
75 μL 75 μL - -
Tampone NSB - 300 μL - -
Antisiero 1,25-(OH)2-D - - 300 μL 300 μL
NOTA: Le provette per il conteggio totale e NSB sono composte mediante aggiunta di
50 μL di etanolo al 95% con 125 μL di tracciante e iniettando con pipetta 75 μL di
questa miscela nella seconda serie di provette.
3. Mescolare bene; lasciare in incubazione per 2 ore (+/- 15 minuti) a 20-25°C.
4. Versare 500 μL di reagente precipitante GAR in tutti i recipienti, eccetto nelle
provette per il conteggio totale.
5. Mescolare bene; lasciare in incubazione per 20 minuti (+/- 5 minuti) a 20-25°C.
6. Centrifugare usando 1800 x g* per 20 minuti a 20-25°C.
7. Far decantare i liquidi superficiali.
8. Contare ogni provetta in un contatore a raggi gamma per 1 minuto.
*g = (1118 x 10-8) (raggio in cm) (rpm)2
87
1,25-DIHYDROXYVITAMIN D 125I RIA KIT
1. AVSEDD ANVÄNDNING
FÖR DIAGNOSTISKT BRUK IN VITRO.
1,25-Dihydroxyvitamin D 125I RIA är en radioimmunoassay som är baserad på
kompetitiv jämvikt och avsedd för kvantitativ analys av 1,25-dihydroxyvitamin D (1,25-
(OH)2-D) i humant serum eller EDTA-plasma. Den används för att påvisa brist på 1,25-
(OH)2-D i samband med njursjukdom. Testresultaten skall användas i kombination med
övriga kliniska data och laboratoriedata för att underlätta för läkaren att fatta beslut om
enskilda vuxna patienters behandling.
2. SAMMANFATTNING OCH FÖRKLARING
D-vitaminet i kroppen kommer från två källor: det är antingen exogent (och härrör från
födan) eller endogent (och härrör från biosyntes reglerad av exponeringen för
ultraviolett ljus). I den exogena (näringsmässiga) källan ingår livsmedel med naturligt
låga halter D-vitamin2 (t.ex. mjölk, smör, D-vitaminberikade spannmålsprodukter2),
kosttillskott i form av vanliga receptfria vitaminpreparat, samt receptbelagda
terapeutiska beredningar med D2 -vitaminer.1 D-vitamin har i sig ingen aktivitet när det
kommer in i blodcirkulationen från födan eller från den fotokemiska processen; den
biologiska aktiviteten uppkommer först efter en komplex serie metaboliska steg.2
Man vet nu att den metaboliska aktiveringen av D-vitamin regleras på ett komplext sätt;
den påverkas i hög grad av exempelvis kostens kalcium- och fosforhalt, graden av Dvitaminbrist,
genetiskt betingade bristtillstånd, halten parathormon, exponering för
ultraviolett ljus och njurfunktionen.3 Biosyntesen av de dihydroxylerade formerna av
vitamin D3 börjar med att ultraviolett solljus verkar på 7-dehydrokolesterol så att
D-vitamin3 bildas i huden. När D-vitamin3 kommer in i cirkulationen tas det snabbt upp
av levern, där det metaboliseras till 25-hydroxyvitamin D3 (25-OH-D3). Levern
hydroxylerar även D-vitamin2 från födan till 25-hydroxyvitamin D2 (25-OH-D2).2,4
Efter hydroxyleringen i levern binds 25-OH-D till D-vitaminbindande protein och
transporteras till njuren där fortsatt hydroxylering äger rum. En hydroxylgrupp kopplas på i
position 1, så att 1,25-dihydroxyvitamin D (1,25-(OH)2-D) bildas.1,25-dihydroxyvitamin D
är den mest potenta naturligt förekommande D-vitaminmetabolit man hittills påträffat, och
bildningen av den regleras noga genom serumhalterna av kalcium, fosfor och
parathormon. Vid kalciumstress är 1,25-(OH)2-D den viktigaste D-vitaminmetaboliten som
bildas i njuren.5,6
Det beror på att den spelar en fundamental roll för den effektiva aktiva absorptionen av
kalcium och fosfor, liksom för deras normala metabolism. Följaktligen håller mätning av
1,25-(OH)2-D snabbt på att bli ett effektivt redskap för forskningen kring sjukdomar och
tillstånd som påverkar den normala fosfor- och kalciummetabolismen.7,8,9
3. ANALYSPRINCIP
DiaSorin 1,25-(OH)2-D-testet består av två steg. Först utförs en förberedande extraktion
och en rening av D-vitaminmetaboliter från serum eller EDTA-plasma med hjälp av
C18OH-kassetter.10 Efter extraktionssteget testas det behandlade provet med hjälp av ett
kompetitivt RIA-test. baserat på en polyklonal antikropp som är specifik för både
1,25-(OH)2 D2 och 1,25-(OH)2D3. Prov, antikroppar och spårämne inkuberas i 2 timmar vid
20 - 25°C. Därefter åstadkommer man en fasseparation genom att inkubera 20 minuter
vid 20-25°C i närvaro av ett utfällningskomplex med en sekundär antikropp. Efter
centrifugering och dekantering räknas den kvarvarande bundna fraktionen i pelletten i
gammaräknare. Värdena beräknas direkt från en kalibreringskurva med kända halter. Den
slutliga halten 1,25-(OH)2D i proverna anges i pg/mL.
88
4. REAGENS I FÖRPACKNINGEN
1,25-(OH)2D NSB-BUFFERT 1 flaska à 3 mL
1,25-(OH)2D KALIBRERINGSLÖSNING O 1 flaska à 20 mL
1,25-(OH)2D3 KALIBRERINGSLÖSNING 1-5 5 flaskor à 3 mL
1,25-(OH)2D ANTISERUM 1 flaska à 35 mL
125 I 1,25-(OH)2D3 1 flaska à 10 mL
1,25-(OH)2D3 FÖRBEHANDLINGSLÖSNING 1 flaska à 50 mL
1,25-(OH)2D GAR UTFÄLLNINGSKOMPLEX 2 flaskor à 35 mL
1,25-(OH)2D KONTROLLSERUM 2 flaskor à 3 mL
95 % ETANOL 1 flaska à 7 mL
Antal test 100
FÖRVARING: Oöppnad förpackning förvaras vid 2-8°C. När förpackningen öppnats
förvaras varje reagens vid 2-8°C till det utgångsdatum som anges på etiketten.
Reagensen får ej användas efter utgångsdatum. Utgångsdatum för satsen anges på
etiketten på ytterförpackningen och motsvarar utgångsdatum för spårämnet.
När man rekonstituerar innehållet i flaskorna måste man blanda försiktigt för att
undvika skumbildning. Alla rekonstituerade reagens skall förvaras vid -15°C eller lägre
omedelbart efter användning. Reagens från skilda batcher får ej blandas.
4.1 1,25-(OH)2D NSB-buffert: Reagens färdigt för användning
Kaliumfosfatgelatinbuffert med ProClin 300 (< 0,2%).
4.2 1,25-(OH)2D 0 Kalibreringslösning: §§Reagens färdigt för användning
Fosfatbuffert med bovina serumproteiner och ProClin 300 (< 0,2%).
4.3 1,25-(OH)2D3 Kalibreringslösningar (1-5): Frystorkade reagens
Fem frystorkade kalibreringslösningar med (1,25-(OH)2D3) i halter på 5 - 200 pg/mL
som innehåller humant serum och ProClin 300 (<0,2%). Varje kalibreringslösning skall
rekonstitueras med 3,0 mL kalibreringslösning noll. De exakta halterna anges på
etiketten på varje flaska. Kalibreringslösningarna i satsen har kalibrerats genom UVmätning.
Kalibreringslösningarna i satsen kan betraktas som likvärdiga med patientprover,
när de används med de reagens och metodanvisningar om rekommenderas för
detta diagnostiska in vitro-test.
4.4 1,25-(OH)2D Antiserum: Reagens färdigt för användning
Anti-1,25-(OH)2D-serum från kanin, spätt med fosfatgelatinbuffert med ProClin 300
(<0,2%).
4.5 125I 1,25-(OH)2D3 Reagens färdigt för användning
1,25-(OH)2D3-analog inmärkt med radioaktivt jod och upplöst i en etylenglykolfosfatbuffert.
4.6 1,25-(OH)2D3 Förbehandlingslösning: Reagens färdigt för användning
Kaliumfosfatbuffert.
4.7 1,25-(OH)2D-kontoller: Nivå 1 (normal), Nivå 2 (förhöjd): Reagens färdigt för
användning
En behandlad humanserumpool som innehåller ProClin 300 (<0,2%) och till vilken
tillsats skett av lämpliga mängder 1,25-(OH)2D för att erhålla kontrollhalter inom de
angivna gränserna. Kontroll 1 ligger inom normalområdet, medan kontroll 2 har ett
förhöjt värde. Koncentrationsområdet för varje kontroll rapporteras på analyscertifikatet
och anger gränserna som fastställts av DiaSorin för kontrollvärden som kan erhållas i
tillförlitliga analysserier.
89
4.8 Fällningskomplex av typen anti-kaninserum från get (GAR): Frystorkat
reagens
Normalt kaninserum, som förutfällts med anti-kaninserum från get och polyetylenglykol
(PEG), späds med BSA-boratbuffert med tillsats av 0,1% natriumazid och andra
konserveringsmedel (frystorkat). Rekonstituera flaskans innehåll med 35 mL destillerat
eller avjoniserat vatten; blanda grundligt tills suspensionen verkar homogen och låt det
sedan stå minst 30 minuter i rumstemperatur. Blanda om då och då.
4.9 95% etanol: Reagens färdigt för användning
95% etanol och 5% vatten.
OBS! C18Även OH-kassetter krävs för denna testprocedur, och måste beställas
separat. Ange DiaSorins katalognummer 65101E.
5. VARNINGAR OCH FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER
FÖR DIAGNOSTISKT BRUK IN VITRO.
Ej avsett för vare sig invärtes eller utvärtes bruk på människor eller djur.
FÖRSIKTIGT! Denna produkt får endast tas emot, förvärvas, ägas och användas av
läkare, kliniska laboratorier, sjukhus och forskningsinstitutioner. Analyserna ska utföras
av laboratoriepersonal med adekvat utbildning och praktisk erfarenhet.
REAGENS SOM INNEHÅLLER MATERIAL AV HUMANT URSPRUNG
Behandlas som potentiellt smittfarligt.
Varje donerad enhet serum/plasma som använts för beredning av produkten har
testats med en metod godkänd av USA:s läkemedelsverk (FDA) och befunnits negativ
vad gäller förekomst av HBsAg, antikroppar mot HCV och antikroppar mot HIV 1/2.
Även om dessa metoder är mycket tillförlitliga, utgör de ingen garanti för att samtliga
infekterade enheter upptäcks. Produkten kan även innehålla annat material av humant
ursprung för vilket det inte finns något godkänt test. Eftersom ingen känd testmetod
kan ge en fullständig garanti för att det inte förekommer hepatit-B-virus, hepatit-C-virus
(HCV), humant immunbristvirus (HIV) eller andra infektiösa agens, skall alla produkter
som innehåller material av humant ursprung hanteras i enlighet med god
laboratoriepraxis och med lämpliga försiktighetsåtgärder enligt handboken “Biosafety in
Microbiological and Biomedical Laboratories” från U.S. Centers for Disease Control
and Prevention/National Institutes of Health, 4:e upplagan, maj 1999, eller aktuell
upplaga.
REAGENS SOM INNEHÅLLER NATRIUMAZID
FÖRSIKTIGT!: Vissa reagens i satsen innehåller natriumazid. Natriumazid kan reagera
med bly och koppar i avloppsledningarna och bilda högexplosiva metallazider. När
reagensen kasseras måste man spola efter med stora mängder vatten för att förhindra
att azid ackumuleras. För ytterligare information hänvisar vi till avsnittet
“Decontamination of Laboratory Sink Drains to Remove Azide Salts” i handboken
Safety Management No. CDC-22 utgiven av Centers for Disease Control and
Prevention, Atlanta, USA 1976.
Europeiska Gemenskapens Riskfraser för farliga preparat (EU-kommissionens
direktiv 1999/45/EC)
R20/21/22 - Farligt vid inandning, hudkontakt och förtäring.
R32 - Utvecklar mycket giftig gas vid kontakt med syra.
S28 - Vid kontakt med huden tvätta genast med mycket vatten.
90
REAGENS SOM INNEHÅLLER ETANOL
Europeiska Gemenskapens Riskfraser för farliga preparat (EU-kommissionens
direktiv 1999/45/EC)
R11 - Mycket brandfarligt
S16 - Förvaras åtskilt från antändningskällor - Rökning förbjuden
S43 - Vid brandsläckning använd pulver eller koldioxid
REAGENS SOM INNEHÅLLER JOD-125
Satsen innehåller radioaktivt material som ej överstiger 5,5 μCi (204 kBq) jod-125.
Adekvata försiktighetsåtgärder måste vidtas och god laboratoriepraxis följas vid
förvaring, hantering och kassering av detta material.
För mottagningar och institutioner som tar emot radioisotoper under en allmän licens:
Detta radioaktiva material får endast tas emot, förvärvas, ägas och användas av
läkare, kliniska laboratorier eller sjukhus, och får endast användas för kliniska tester in
vitro eller laboratorietester in vitro, vilka ej innebär någon invärtes eller utvärtes
administrering av materialet, eller av strålning från det, till människor eller djur. För
mottagande, förvärv, innehav, användning och överlåse gäller de regler och den
allmänna licens som utfärdats av den amerikanska Nuclear Regulatory Commission
eller av den stat med vilken kommissionen har ingått ett avtal för utövande av
regulatorisk myndighet.
1. Radioaktivt material får endast förvaras på en speciellt avsedd plats.
2. Endast auktoriserad personal får ha tillgång till radioaktivt material.
3. Pipettera aldrig radioaktivt material med munnen.
4. Undvik att äta eller dricka i lokaler där radioaktivt material används.
5. Ytor där spill kan förekomma skall torkas av och därefter rengöras med ett alkaliskt
rengöringsmedel eller radiologisk dekontamineringslösning. Alla glasvaror som
används måste sköljas noga med vatten innan de diskas tillsammans med andra
glasvaror för laboratoriebruk.
För mottagningar och institutioner som tar emot radioisotoper under en specifik licens:
När ni tar emot, använder, överlåter och kasserar radioaktivt material gäller reglerna
och villkoren i er specifika licens.
VARNING! Produkten innehåller en kemikalie som enligt staten Kalifornien är känd för
att orsaka cancer.
OBSERVERA! Den radioaktivitet som anges på bipacksedeln kan skilja sig något från
den aktivitet som anges på etiketterna på kartongen och på flaskan med spårämnet.
Etiketterna på kartongen och på flaskan med spårämnet anger den verkliga
radioaktivitetsmängden vid kalibreringsdatum, medan bipacksedeln anger den
teoretiska radioaktiviteten för satsen.
6. TECKEN SOM KAN TYDA PÅ EN KVALITETSFÖRSÄMRING HOS
REAGENSEN I SATSEN
6.1 Förekomst av onormalt partikelformigt material i något av reagensen.
6.2 En förändring av kalibreringskurvans läge eller lutning jämfört med vad som
erhålls normalt.
6.3 En sänkning av maximal bindning.
6.4 En hög ospecifik bindning
7. PROVTAGNING OCH HANTERING AV SERUM OCH PLASMA
Det behövs 500 mikroliter serum eller EDTA-plasma för att utföra extraktionen inför
assayen; med en volym på 1,5 ml kan man upprepa analysen samtidigt som man får
marginal för pipetteringen.
91
Satsen kan användas både med humant serum och human plasma. EDTA kan
användas som antikoagulanstillsats med denna assay. Fasteprov rekommenderas men
är ej ett krav. Blodprovet bör tas med aseptisk teknik genom venpunktion med ett
5 eller 10 mL rör av vacutainertyp. För att få serum låter man blodet koagulera i
rumstemperatur (15-25°C). Centrifugera i 15 minuter vid cirka 760 x g* så att
hemolysfria serumprover erhålles. Inga tillsatser eller konserveringsmedel behövs för
att bibehålla intakta prover. Alla plastartiklar, glasvaror och annan materiel som
kommer i kontakt med provet måste vara fullkomligt fria från kontaminerande material.
Serum- eller plasmaprover kan lagras vid -15°C eller lägre. Proverna får ej frysas och
tinas flera gånger; ingen signifikant förändring av värdena sågs dock i en studie
genomförd av DiaSorin, där proverna genomgick 3 cykler med frysning-upptining.
DiaSorin har lagrat prover i upp till 6 månader vid -15°C eller lägre utan någon
signifikant förändring av resultaten.
8. EJ TILLHANDAHÅLLEN MEN NÖDVÄNDIG UTRUSTNING OCH MATERIEL
8.1 C18OH-kassetter (24 kassetter), som beställs separat med DiaSorins katalognummer
65101E.
8.2 Engångs borosilikatglasrör, 12 x 75 mm och 13 x 100 mm.
8.3 Provrörsställ.
8.4 Parafilm eller motsvarande för att täcka över provrören.
8.5 Frigolitställ eller motsvarande för dekantering.
8.6 Centrifug med plats för 12 x 75 mm-rör och möjlighet att uppnå 1800 x g*.
8.7 Gammaräknare som kan räkna 125I.
8.8 Vortex-blandare.
8.9 Pipetteringshjälpmedel:
a. Mikropipetter kalibrerade för 75 μL, 300 μL och 500 μL.
b. Repeterande dispensorer för 50 μL, 300 μL och 500 μL.
c. Mätpipetter för rekonstituering av kalibreringslösningar; 3,0 mL.
8.10 Avjoniserat eller destillerat vatten.
8.11 Organiska lösningsmedel:
Följande lösningsmedel behövs för att förbereda och extrahera proverna.
Använd endast lösningsmedel av HPLC-kvalitet.
Låt inte något lösningsmedel komma i kontakt med syradiskade
glasvaror eller andra sura betingelser.
a. Acetonitril.
b. Metanol.
c. Hexan. (VIKTIGT! halten n-hexan måste vara minst 95%)
d. Metylenklorid (får ej innehålla alkohol som konserveringsmedel).
e. Isopropanol (2-propanol).
8.12 Rekommenderad apparat för C18OH-kassetterna:
a. Vac Elut provbehandlingsstation. Behandlar 24 kolonner per körning. Kan
beställas från Analytichem International eller DiaSorin. Vid beställning
från DiaSorin används DiaSorins katalognummer 11610.
* g = (1118 x 10-8 ) (radie i cm) (rpm)2
92
8.13 Erforderlig materiel för torkning av prover:
a. Kvävgas.
b. Torkgrenrör med 37°C (±2°C) värmeblock eller vattenbad:
N-EVAP eller MULTI-VAP som kan beställas från Organomation
Associates (Berlin, Massachussetts, USA) eller Reacti-Vap II och Reacti-
Therm III som kan beställas genom Pierce Chemical Company (Rockford,
Illinois, USA).
9. BEREDNING AV ORGANISKA LÖSNINGSMEDEL FÖR
KOLONNEXTRAKTIONEN
OBS! De organiska lösningsmedelsblandningarna skall beredas innan man
påbörjar den förberedande extraktionsproceduren.
FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER:
Bered lösningsmedelsblandningar enligt beskrivningen i TABELL I; DiaSorin rekommenderar
att man bereder 500 mL. Man kan bereda större eller mindre volymer så
länge som proportionerna förblir de samma. Volymerna måste dock vara tillräckligt
stora för att man skall kunna minimera mätfelet. Mät upp varje lösningsmedel separat
för bästa resultat.
FÖRSIKTIGHETSÅTGÄRDER:
Använd destillerat eller avjoniserat vatten i förekommande fall.
TABELL I
Beredning av lösningsmedel
Proportioner Lösningsmedel 1 L 500 mL
metanol 700 mL 350 mL
70:30 vatten 300 mL 150 mL
hexan 900 mL 450 mL
90:10 metylenklorid 100 mL 50 mL
hexan 990 mL 495 mL
99:1 IPA 10 mL 5 mL
hexan 920 mL 460 mL
92:8 IPA 80 mL 40 mL
10. FÖRBEREDANDE EXTRAKTIONSPROCEDUR
10.1 Rekonstituera varje frystorkad kalibreringslösning med 3,0 mL kalibreringslösning
noll. Blanda kalibreringslösningarna väl och låt dem stå 15 - 20
minuter så att rekonstitueringen blir fullständig. Tina eventuella frysta reagens
helt och hållet. Låt alla reagens anta rumstemperatur. Se till att reagensen ej
blir varmare än 25°C. Blanda alla reagens väl före användning.
10.2 Pipettera över 500 μL av varje kalibreringslösning (0-5), av kontroll och av
patientprov till märkta 12 x 75 mm borosilikatglasrör.
10.3 Tillsätt 500 μL acetonitril till varje prov; vortexa då och då, minst 3 gånger,
under en tidrymd av 10 minuter.
10.4 Centrifugera rören vid 760 x g* i 10 minuter vid 20 - 25°C.
10.5 Dekantera supernatanterna från proverna till märkta 12 x 75 mm-rör eller (om
så önskas) 13 x 100 mm-rör; kassera pelletterna.
* g = (1118 x 10-8 ) (radie i cm) (rpm)2
93
10.6 Tillsätt 500 μL förbehandlingslösning till varje rör och vortexa.
OBS! Satsen räcker till maximalt 48 extraktioner, vilket innebär 40 okända
prover förutom kalibreringslösningar och kontroller. Således kan 24 prover
extraheras genast på VacElut-enheten och de återstående 24 senare.
Kolonnextraktionerna skall utföras så snart som möjligt efter det att
förbehandlingslösningen tillsatts. När kolonnextraktionen väl har utförts kan
dock proverna lagras i 96 timmar vid -15°C eller lägre.
10.7 Proverna är nu klara att applicera på C18OH-kassetterna.
11. KOLONNPROCEDUR
11.1 I bruksanvisningen till VAC ELUT finns en beskrivning av hur den fungerar.
Sätt ihop stationen enligt anvisningarna.
11.2 Märk upp ett 13 x 100 mm borosilikatglasrör för varje kalibreringslösning (0-5),
kontroll och okänt prov. Sätt i rören i VAC ELUT. Kontrollera att locket på VAC
ELUT är i läge "WASTE" och att rören är placerade så att de samlar upp rätt
eluat. Placera C18OH-kassetterna på VAC ELUT-locket.
11.3 Tillsätt lösningsmedelsblandningarna till angiven kassett enligt tabell II.
VIKTIGT!
Användning av vakuum:
Sätt på vakuum efter varje tillsats av lösningsmdel och låt lösningsmedelsblandningen
passera fullständigt genom kassetten innan du går vidare med
nästa lösningsmedel. Slå på och slå av vakuum vid de angivna stegen i TABELL
II (om så önskas kan vakuum slås av mellan varje lösningsmedelstillsats).
Vakuumet skall vara inställt på högst 254 mm Hg (10 tum Hg). Eluera varje
lösningsmedels-blandning genom "WASTE"-utloppet till lämpliga avfallskärl fram
till det sista uppsamlingssteget.
Applicering av prov:
Proverna kan antingen dekanteras direkt på kassetten eller appliceras med pipett.
Låt inte kassetterna lufttorka i mer än 5 minuter mellan appliceringarna.
Förbehandling av C18OH-kassetterna:
C18OH-kassetterna skall tvättas med 5 mL hexan-metylenklorid (90:10), 5 mL IPA och
5 mL metanol innan de används första gången. Hexan-metylenkloridblandningen
(90:10) kan beredas genom att man mäter upp 900 mL hexan och 100 mL
metylenklorid. Placera de nya, oanvända kassetterna på VAC ELUT-apparaten, ställ
den i läge "WASTE" och tillsätt 5 mL hexan-metylenklorid (90:10) till varje kolonn, följt
av 5 mL IPA och slutligen 5 mL metanol. Låt varje lösningsmedelsblandning passera
helt genom kassetterna innan du går vidare med nästa blandning. När man på detta
sätt förberett de nya kassetterna behöver man i fortsättningen inte upprepa detta steg,
eftersom kassetterna regenereras under extraktionen.
OBS! Om ytterligare prover skall extraheras (fler än 24), regenererar man kassetterna
med samma metod som i TABELL II. Kassetterna kan återanvändas upp till
30 gånger.
OBS! Materialet i C18OH-kassetterna hålls på plats av en porös fiberfritta. Kassera
kassetter där fibrer i frittan är lösa eller saknas eftersom C18OH-material kan gå
förlorat.
94
TABELL II
Beskrivning och analys av
extraktionen
Extraktionssteg Hantering av
elueringsvätska
1. Tillsätt 1 mL metanol, slå på
vakuum.
Förberedelse/regenerering av
kolonn Avlägsnar: Interfererande
substanser från föregående
användning (steg 1) 2. Slå av vakuum.
Kassera
“WASTE”
Applicering av prov
3. Applicera alla prover, slå på
vakuum. från Förberedande
extraktionsprocedur (steg 10).
Kassera
“WASTE”
Rening/avlägsnande av Dvitaminmetaboliter
4. Tillsätt 5 mL metanolvattenblandning
(70:30;
avjoniserat eller destillerat
vatten).
Avlägsnar: Interfererande polära
lipider, salter och pigment (steg 4)
5. Tillsätt 5 mL
hexan/metylenklorid (90:10).
25(OH)D (steg 5) 6. Tillsätt 5 mL
hexan/isopropanol (99:1).
Återstående 25(OH)D och 24,25(OH)2
D/25,26(OH)2 D (steg 6)
7. Slå av vakuum.
Kassera
“WASTE”
Tillvaratagande av 1,25-(OH)2 D VIKTIGT!
Eluering av renat 1,25-(OH)2 D
(steg 9)
8. Slå om Vac Elut till läge
"Collect:"
9. Tillsätt 3 mL
hexan/isopropanol (92:8), slå
på vakuum.
10. Slå av vakuum.
“COLLECT”
12. TORKNING OCH REKONSTITUERING AV ELUATEN
12.1 Placera provrören med eluaten i ett värmeblock eller vattenbad vid 37°C
(±2°C) för torkning.
12.1 Torka eluaten i dragskåp med 2-4 psi kvävgas (torktid 20-30 minuter).
12.3 Ta ut rören så snart eluaten har torkat.
12.4 Rekonstituera vart och ett av de torkade extrakten med 50 μL 95%
etanol; vortexa försiktigt på låg till medelhög hastighet. Tillsätt 125 μL
spårämne till varje rör, vortexa igen försiktigt på låg till medelhög hastighet.
OBS! Vortexstegen är mycket viktiga för att proverna ska rekonstitueras på
rätt sätt och för att man skall få bra precision. FÖRSIKTIGT! Håll
vortexblandaren mot den nedersta delen av röret, så att ingen provvolym går
förlorad; det är viktigt att volymen är så stor att det går att pipettera prov till
assayen. Märk upp ett extra rör för total aktivitet och ett rör för NSB. Tillsätt
50 μL 95 % etanol och 125 μL spårämne till båda rören. De kommer att
användas för att skapa dubbelproverna för TA (total aktivitet) och NSB enligt
testschemat.
12.5 Utför assayen omedelbart när proverna rekonstituerats. Vid större assayer
bör man för bästa resultat rekonstituera 12 - 15 prover i taget och sedan
pipettera dem till assayen, innan man rekonstituerar de följande 12 - 15
proverna.
95
13. TESTPROCEDUR
13.1 Gör i ordning märkta 12 x 75 mm engångs borosilikatglasrör för dubbelprover
för varje kalibreringslösning (0-5), kontroll och prov enligt testschemat.
Pipettera noggrant 75 μL rekonstituerat extrakt av kalibreringslösning, kontroll
eller prov till respektive rör.
FÖRSIKTIGT!: Var mycket noggrann vid detta steg, eftersom det bara finns
25 μL extra i varje rör.
13.2 Se "Torkning och rekonstituering av eluaten" steg 4. Pipettera 75 μL från röret
för TA (total aktivitet) till motsvarande dubbla assayrör. Gör på motsvarande
sätt med NSB-rören.
13.3 Tillsätt 300 μL NSB-buffert till NSB-rören.
13.4 Tillsätt 300 μL primär antikropp till alla rör utom rören för total aktivitet och
NSB.
13.5 Blanda väl; inkubera 2 timmar (±15 minuter) vid 20 - 25°C.
OBS! Rekonstituera GAR utfällningskomplex med 35 mL destillerat eller
avjoni-serat vatten, blanda grundligt tills suspensionen ser homogen ut och låt
den sedan stå i minst 30 minuter i rumstemperatur innan den används. Blanda
om då och då före och under användning.
13.6 Tillsätt 500 μL välblandat GAR utfällningskomplex till alla rör utom totalaktivitetsrören.
Inkubera 20 minuter (±5 minuter) vid 20 - 25°C.
13.7 Centrifugera alla rör i 20 minuter vid 20 - 25°C och 1800 x g*, utom totalaktivitetsrören.
13.8 Dekantera supernatanterna, utom från totalaktivitetsrören. Använd ett
frigolitställ eller liknande och vänd det upp-och-ner över lämpligt avfallskärl.
Ställ det upp-och-ner-vända stället på absorberande papper i 2-3 minuter.
Tryck försiktigt ett filtrerpapper mot mynningen på rören så att all vätska säkert
sugs upp.
13.9 Mät radioaktiviteten genom att räkna alla rör 1 minut i en gammaräknare.
Rören måste räknas i minst 1 minut (se avsnittet Metodbegränsningar).
14. KOMMENTARER TILL PROCEDURERNA
14.1 Tillsätt alla reagens till den nedersta tredjedelen av provröret så att reagensen
kan blandas fullständigt.
14.2 För att utbytena skall bli goda måste proportionerna mellan lösningsmedlen
vara korrekta. Bered tillräckligt stora volymer av blandningarna för att mätfel
skall minimeras.
14.3 Om ett prov ger ett högre värde än den högsta kalibreringslösningen, skall
man späda provet med kalibreringslösning noll före extraktion och därefter
testa det på nytt. Resultatet skall sedan multipliceras med motsvarande
spädningsfaktor. Exempel: Blanda 500 μL prov med 500 μL kalibreringslösning
noll. Kör därefter assay på 500 μL av denna provblandning enligt bipacksedeln.
14.4 Ingen drift i assayresultatet iakttogs under den genoittliga tid det tar att
utföra assay på 100 rör.
* g = (1118 x 10-8 ) (radie i cm) (rpm)2
96
14.5 För att kontinuerligt bekräfta att ett RIA-test ger konsekventa resultat måste
laboratoriet kontrollera ett antal andra faktorer. DiaSorin rekommenderar att
man regelbundet kontrollerar följande parametrar för att vara säker på att
satsen ger konsekventa resultat.
a. Totalaktivitet
b. Maximal bindning
Medelvärdet för aktiviteten (CPM) i rören för kalibreringslösning noll/CPMmedelvärdet
för totalaktivitetsrören.
c. Ospecifik bindning
CPM-medelvärdet för NSB-rören/CPM-medelvärdet för total aktivitetsrören.
d. Kalibreringskurvans lutning
Nivån för 50 % hämning kan följas.
15. KVALITETSKONTROLL
Varje laboratorium bör ta med minst två kontroller (en med normal nivå och en med
förhöjd nivå) i varje assaykörning för att kontinuerligt övervaka metodegenskaperna.
Kommersiellt tillgängliga kontroller eller de båda referenskontrollerna i satsen kan
användas.
Kontrollerna ska behandlas exakt som okända prover och köras som duplikat. Man bör
kontinuerligt föra in kontrollvärdena i diagram för att kunna följa hur väl kontrollerna
ligger. Godtagbara områden för varje kontroll bör fastställas av varje enskilt
laboratorium med hjälp av statistiska metoder för att påvisa både slumpmässiga och
systematiska fel. Resultaten för kontrollerna måste uppfylla laboratoriets kriterier för
godkännande innan patientprovsresultaten rapporteras.12,13,14
16. RESULTATBERÄKNING
Det finns många olika metoder för att beräkna resultaten från RIA-test. Alla är
baserade på att man tar fram en kalibreringskurva genom att plotta bindningsgraden
mot de angivna koncentrationerna hos kalibreringslösningarna. Diagrammet kan ha
antingen linjär eller logaritmisk skala. Samtliga metoder ger i stort sett samma värden
för kontroller och prover, även om en viss beräkningsmetod kan passa bättre för vissa
assayer än för andra. Den beräkningsmetod som används på DiaSorins kvalitetskontrollaboratorium
är en metod där %B/B0 avsätts mot logaritmen för koncentrationen
med hjälp av ett program för mjuk anpassning till SPLINE-funktioner.
16.1 Beräkning av procent B/B0
a. Beräkna medel-CPM för varje kalibreringslösning, kontroll och okänt prov.
b. Subtrahera medel-CPM för NSB-rören från alla värden.
c. Dividera det korrigerade CPM-värdet för varje kalibreringslösning, kontroll
och okänt prov med medelvärdet av de korrigerade CPM-värdena för
0-kalibreringslösningen och multiplicera med 100.
medel- CPM (kalibreringslösning eller okänt prov) - medel- CPM (NSB)
medel- CPM (0-kalibreringslösning) - medel- CPM (NSB) x 100 = B/B0 (%)
16.2 Den uppritade kalibreringskurvan
a. Använd ett lin-log-papper över två tiopotenser eller log-log-papper och
plotta procent B/B0 (%) förkalibreringslösningarna på den lodräta axeln
(y-axeln) mot kalibreringslösningarnas koncentration på den vågräta axeln
(x-axeln).
97
OBS! Man kan även analysera data med hjälp av automatiska datareduktionsprogram.
DiaSorin använder Multi-Calc (Pharmacia) med en mjuk
LIN-LOG-anpassning till SPLINE-funktioner. Andra datareduktions-metoder
måste valideras innan de används rutinmässigt.
b. Rita en bästa anpassad linje genom punkterna.
c. Använd kurvan för att avläsa 1,25-(OH)2D-halterna i proverna.
d. Om ett okänt prov har spätts, korrigerar man för spädningsfaktorn.
e. Det rapporterbara området för assayen är 5,0 pg/mL - 200 pg/mL.
Eventuella värden som ligger under den lägsta kalibreringslösningen,
5,0 pg/mL, är extrapolerade och kan rapporteras som “mindre än
5 pg/mL”.
f. Beräkna maximal bindning genom att dividera CPM för 0-lösningen med
medelvärdet för totalaktivitetsrören.
I TABELL IV och FIGUR 1 visas ett exempel på typiska data för 1,25-(OH)2DRIA;
denna information är endast avsedd som exempel och skall inte användas för att
beräkna några värden.
TABELL IV
Exempeldata för DiaSorin 1,25-(OH)2D-RIA
Rör
CPM i
dubbelprov
Medel-
CPM
Korrigerad
CPM
Procent
bundet
(B/T)
Procent
(B/B0)
Konc.
(pg/mL)
Total aktivitet 40.792 40.685
40.578
NSB 1.438 1.439 3,5
1.439
0-kalibrering 18.006 18.063 16.624 44,4 100,0
18.119
Kalibreringslösningar
(pg/mL)
1 (5,0) 16.710 16.740 15.302 92,0
16.770
2 (15,0) 14.941 14.929 13.490 81,2
14.916
3 (30,0) 13.087 13.106 11.667 70,2
13.124
4 (75,0) 9.820 9.793 8.354 50,2
9.765
5 (200) 6.412 6.438 5.000 30,0
6.464
Kontroller
Nivå 1: 13.275 13.403 11.964 72,0 27,3
normal nivå 13.530
Nivå 2: 8.206 8.165 6.727 40,5 119
hög nivå: 8.124
98
Exempel på kalibreringskurva för DiaSorin 1,25-(OH)2D-RIA
FIGUR 1
DATAREDUKTION
DiaSorins kvalitetskontrollaboratorium använder en mjuk anpassning till SPLINEfunktioner.
17. METODBEGRÄNSNINGAR
17.1 Aktiviteten i rören måste räknas under så lång tid att statistiska fel undviks (till
exempel ger en räkning av 2000 CPM ett fel på 5%; 10000 CPM ger ett fel
på 1%).
17.2 Resultaten från testet skall användas i kombination med övriga kliniska data
och laboratoriedata för att underlätta när läkaren fattar beslut om den enskilda
patientens behandling.
17.3 Prestanda för testet har inte kontrollerats i en pediatrisk population.
18. FÖRVÄNTADE VÄRDEN
Referensområde för friska blodgivare
Det är viktigt att varje laboratorium upprättar ett eget referensområde som är
representativt för det typiska patientunderlaget vid laboratoriet. Det har dock
genomförts en klinisk studie där man under sommar- och höstmånaderna samlade
1,25-(OH)2D-värden från 123 friska frivilliga i tre städer i amerikanska Mellanvästern.
Dessa 123 friska blodgivare utgjorde en rasmässigt blandad grupp med 37 män och
86 kvinnor mellan 21 och 68 år. Medelvärdet för 1,25-(OH)2D-halten för hela gruppen
(n=123) låg på 43,9 pg/mL. Det 95-procentiga referensintervallet, uppskattat med en
icke-parametrisk metod (enligt CLSI:s riktlinje C28-A215), var 25,1-66,1 pg/mL.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 10 100 1000
pg/mL
% B/Bo
99
Patienter med terminal njursjukdom
En klinisk prövning genomfördes för att utvärdera 1,25-(OH)2D-nivåerna hos en vuxen
population med diagnosen terminal njursjukdom. Totalt rekryterades och testades
87 frivilliga i denna kategori (49 män, 38 kvinnor, ålder 19-84) från tre städer i
amerikanska Mellanvästern. Det observerade området för 1,25-(OH)2D-värden för
denna population (n=87) var 1,6-17,3 pg/mL. Den övre gränsen för det 95-procentiga
referensområdet, uppskattat med en icke-parametrisk metod, låg på 14,2 pg/mL.
19. SPECIFIKA PRESTANDA
19.1 Precision
DiaSorin utvärderade precisionen för assayen baserat på principerna i CLSI:s riktlinje
(EP5-A).16 Tre kontroller, baserade på humant serum och med nivåer av 1,25-(OH)2-D
fördelade över hela området för assayen, testades under 25 testdagar omfattande mer
än 60 driftdagar. Flera olika analytiker och flera olika batchnummer för samtliga
komponenter ingick. De kombinerade resultaten utvärderades genom variansanalys
(ANOVA) och är sammanfattade i följande tabell.
Inom samma
körning
Mellan
dagar Totalt
Prof N
Medelvärde
pg/mL S.D. % CV S.D. % CV S.D. % CV
LÅG 25 25,8 1,76 6,8 3,8 14,6 4,0 15,3
MEDEL 25 41,3 3,16 7,7 4,6 11,1 5,1 12,3
HÖGT 25 105,2 11,86 11,3 11,8 11,2 14,4 13,7
19.2 RIKTIGHET: RIKTIGHETEN FÖR ASSAYEN KONTROLLERADES MED ETT
LINEARITETSTEST OCH ETT UTBYTESTEST.
Linearitet (parallellitet)
Lineariteten vid spädning utvärderades av DiaSorin enligt rekommendationerna i
CLSI's riktlinje EP6-P.17 Tre pooler av patientsera bereddes genom seriespädning med
kalibreringslösning noll och uppdelades i portioner som frystes till –20°C Varje prov och
spädning testades upprepade gånger på tre olika testdatum. De förväntade
värdena bestämdes som de ospädda värdena för varje pool dividerat med spädningsfaktorn.
Data sammanfattas nedan och de sammanslagna resultaten plottades som en
linjär regression av Förväntat värde mot Observerat värde.
100
Prov Nr Spädning
Förväntat Värde
(pg/mL) (N=10)
Medelvärde För
Observerat Värde
(pg/mL) (N=10)
1 OUTSPÄDD 49,6 49,6
1:2 24,8 25,3
1:4 12,4 11,1
1:8 6,2 4,4
2 OUTSPÄDD 50,2 50,2
1:2 25,1 24,2
1:4 12,6 12,2
1:8 6,3 4,6
3 OUTSPÄDD 62,0 62,0
1:2 31 31,9
1:4 15,5 13,4
1:8 7,8 6,2
UTBYTE
Testets förmåga att ge ett kvantitativt utbyte av all analyt i de kliniska proverna
utvärderades genom tillsats av varierande mängder nypreparerat, rent 1,25-(OH)2-Dantigen
till tre patientprovspooler. Tre halter valdes och testades i dubbelprover, och
utbytet bestämdes som en procentandel. Medelvärdet för utbytet med denna metod var
101%.
Prov nr
Urspr. konc
(pg/mL)
1,0 mL
Tillsatt
mängd (pg)
*Förväntat
(pg/mL)
Observerat
(pg/mL) % utbyte
1 50,0 77,7 75,6 97
30,8 62,5 88,9 87,2 98
75,0 99,8 103 103
2 50,0 89,2 89,5 100
42,8 62,5 100,3 98,9 99
75,0 111,0 118 106
3 50,0 86,8 83,9 97
40,3 62,5 97,9 103 105
75,0 108,8 118 108
*Vid beräkningarna för förväntad halt tas hänsyn till den spädningsfaktor som den
tillsatta volymen ger upphov till.
101
19.3 Analytisk känslighet
Känsligheten hos assayen, definierat som den lägsta koncentration som kan särskiljas
från noll vid 2 standardavvikelser under medel-CPM för 0-kalibreringslösningen
(n = 20), har visat sig ligga på <2,0 pg/mL.
19.4 Analytisk specificitet
Data för korsreaktiviteten för det antiserum som används i satsen uttrycks som kvoten
mellan koncentrationen av 1,25-OH-2D3 och koncentrationen av det korsreagerande
ämnet vid 50 % hämning av maximal bindning.
Analyt Konc. Vid 50% B/Bo % korsreaktivitet
24,25 D3 76.420 pg/mL <0,5
25,26 D3 24.330 pg/mL <0,5
25 D3 >>>1 mg/mL <0,5
19.5 Interfererande ämnen
En studie av potentiella interfererande ämnen genomfördes för att fastställa om höga
halter av vanliga endogena substanser kan påverka assayresultaten negativt.
Utvärderingen följde CLSI:s riktlinjer (EP7-P).18 Tre prover baserade på humant serum
och med låga, medelhöga eller höga halter av 1,25-(OH)2-D3 testades antingen med
tillsats av det testade ämnet eller som kontroller med tillsats av samma volym av den
buffert som det testade ämnet var löst i. Varje prov extraherades två gånger, vilket gav
fyrdubbla assayprover. Resultaten nedan visar att det inte föreligger någon interferens
från något av de testade ämnena, vilket fastställdes genom statistisk analys med
ANOVA (95% konfidensintervall), eller genom att medelvärdet för proverna med tillsats
avvek från kontrollerna med mer än ± 2 standardavvikelser för kalibreringslösningarna.
Bilirubin
Prov
Medelvärde
för kontroll
(pg/mL)
2 SD för
kontrollen
Medelvärde med
bilirubintillsats
(pg/mL)
Interferens
enl. ANOVA
Lågt 19,9 18,5-21,3 19,5 0,54
Medel 31,7 27,7-35,7 29,9 0,22
Högt 79,7 63,5-95,9 83,2 0,45
Kolesterol
Prov
Medelvärde
för kontroll
(pg/mL)
2 SD för
kontrollen
Medelvärde
med
kolesteroltillsats
(pg/mL)
Interferens
enl.
ANOVA
Lågt 19,9 18,5-21,3 19,4 0,64
Medel 31,7 27,7-35,7 29,7 0,15
Högt 79,7 63,5-95,9 75,2 0,40
102
Triglycerider
Prov
Medelvärde
för kontroll
(pg/mL)
2 SD för
kontrollen
Medelvärde
med
triglyceridtillsats
(pg/mL)
Interferens
enl.
ANOVA
Lågt 14,7 12,9-16,5 15,1 0,88
Medel 30,4 22,4-38,4 33,4 0,25
Högt 92,6 69,5-116,9 95,4 0,68
Hemoglobin
Prov
Medelvärde
för kontroll
(pg/mL)
2 SD för
kontrollen
Medelvärde med
hemoglobintillsats
(pg/mL)
Interferens
enl.
ANOVA
Lågt 21,5 17,5-25,5 20,8 0,53
Medel 38,6 35,4-41,8 40,0 0,43
Högt 112,7 101,4-124,0 120,6 0,17
Urea
Prov
Medelvärde
för kontroll
(pg/mL)
2 SD för
kontrollen
Medelvärde med
ureatillsats
(pg/mL)
Interferens
enl.
ANOVA
Lågt 25,1 20,9-29,3 26,6 0,39
Medel 36,2 23,8-48,6 35,9 0,96
Högt 120,1 97,4-142,8 118,6 0,82
FÖR REFERENSER HÄNVISAS TILL SISTA SIDAN
103
LATHUND FÖR TESTET
1. Kalibreringslösningar, kontroller och okända prover rekonstitueras alla med
95 % etanol och spårämne efter torksteget i kolonnproceduren.
2. Pipettera reagens enligt följande schema:
Rör/Reagens Totalaktivitet NSB
CAL
0-5
Kontroller och
okända prover
Rekonstituerade
kalibreringslösningar - - 75 μL -
Rekonstituerade kontroller
och okända prover - - - 75 μL
95 % etanol och spårämne** 75 μL 75 μL - -
NSB-buffert - 300 μL - -
1,25-(OH)2-D-antiserum - - 300 μL 300 μL
OBS! Man gör i ordning rören för total aktivitet och NSB genom att blanda 50 μL 95%
etanol och 125 μL spårämne, och pipettera 75 μL av denna blandning till rör för
dubbelprover.
3. Blanda väl; inkubera 2 timmar (+/- 15 minuter) vid 20-25°C.
4. Pipettera 500 μL GAR utfällningsreagens till alla rör utom dem för total
aktivitet.
5. Blanda väl; inkubera i 20 minuter (+/-5 minuter) vid 20-25°C.
6. Centrifugera vid 1800 x g* i 20 minuter vid 20-25°C.
7. Dekantera supernatanterna.
8. Räkna varje rör i gammaräknare i 1 minut.
*g = (1118 x 10-8) (radie i cm) (rpm)2
104
SOUPRAVA 125I RIA KE STANOVENÍ 1,25-dihydroxyvitamÍnU D
1. POUŽITÍ
PRO DIAGNOSTICKÉ ÚČELY IN VITRO
Test 125I RIA ke stanovení 1,25-dihydroxyvitamínu D je kompetitivní rovnovážná
radioimunoanalýza určená ke kvantitativnímu stanovení 1,25-dihydroxyvitamínu D
(1,25-(OH)2-D) v lidském séru nebo v EDTA plazmě, jejímž cílem je zhodnocení
deficience 1,25-(OH)2-D, spojené s onemocněním ledvin. Při rozhodování o léčbě
dospělých pacientů je nutné, aby kliničtí lékaři využívali výsledky testů společně s
dalšími klinickými a laboratorními údaji.
2. SOUHRN A VYSVĚTLENÍ
Vitamín D je získáván se dvou zdrojů: exogenního (strava) a endogenního (biosyntéza
regulovaná expozicí ultrafialovému záření). Exogenní, neboli nutriční zdroje zahrnují
potraviny obsahující přirozeně nízký obsah vitamínu D2 (např. mléko, máslo, cereálie
obohacené vitamínem D2), potravinové doplňky ve formě pohotově dostupných volně
prodejných vitamínů a lékové přípravky s obsahem vitamínů D2.1 Vitamín D není ze své
podstaty aktivní, když vstoupí do oběhu, a to ať stravou, či fotochemickou cestou.
Biologickou aktivitu získává po složité řadě metabolických kroků.2
V současné době je známo, že metabolická aktivace vitamínu D je složitě řízený
proces, kde do hry vstupuje velký počet do značné míry variabilních proměnných, mezi
něž patří obsah vápníku a fosforu ve stravě, závažnost deficience vitamínu D,
genetické predispozice, hladina parathormonu, expozice ultrafialovému záření a stupeň
funkčnosti ledvin.3 Biosyntéza hydroxylovaných forem vitamínu D3 začíná působením
ultrafialového slunečního záření na 7-dehydrocholesterol za vytváření vitamínu D3 v
pokožce. Jakmile vitamín D3 vstoupí do oběhu, je rychle metabolizován v játrech na 25-
hydroxyvitamín D3 (25-OH-D3). V játrech se také hydroxyluje vitamín D2 ze stravy na
25-hydroxyvitamín D2 (25-OH-D2).2,4
Po hydroxylaci v játrech se 25-OH-D transportuje spolu s bílkovinou, která váže vitamín
D, do ledvin, kde dochází k další hydroxylaci. Adicí hydroxylové skupiny na pozici 1 se
tvoří 1,25-dihydroxyvitamín D (1,25-(OH)2-D). 1,25-dihydroxyvitamín D je nejúčinnější
přirozeně se vyskytující metabolit vitamínu D, který byl dosud objeven, a jeho produkce
je přesně regulována koncentrací vápníku, fosforu a parathormonu v séru. V době
kalciového stresu je 1,25-(OH)2-D nejdůležitějším metabolitem vitamínu D,
produkovaným v ledvinách.5,6
Je to způsobeno jeho důležitou úlohou při účinném vstřebávání vápníku a fosforu i
při jejich normálním metabolismu. Z toho vyplývá, že měření 1,25-(OH)2-D se rychle
stává účinným nástrojem výzkumu onemocnění a poruch ovlivňujících normální
metabolismus fosforu a vápníku.7,8,9
3. PRINCIP ANALÝZY
Test DiaSorin 1,25-(OH)2 sestává z dvoustupňového postupu. Test zahrnuje
předběžnou extrakci a následnou purifikaci metabolitů vitamínu D ze séra nebo plazmy
EDTA pomocí patron C18OH.10 Po extrakci se připravený vzorek analyzuje pomocí
kompetitivní RIA. Metoda RIA je založena na polyklonálních protilátkách specifických
pro 1,25-(OH)2D2 i pro 1,25-(OH)2D3. Vzorek, protilátka a izotopový indikátor se inkubují
2 hodiny při 20-25 °C. Separace fází se provádí po 20 minutách inkubace
při 20-25 °C precipitační složkou – druhou protilátkou. Po centrifugaci a dekantaci se
změří vázaná frakce zbývající v tabletě pomocí detektoru gama záření. Hodnoty se
vypočítají přímo z kalibrační křivky známých koncentrací. Konečná koncentrace
1,25-(OH)2D ve vzorcích séra a EDTA plazmy je vyjádřena v pg/ml.
105
4. REAGENS DODANÉ V SOUPRAVĚ
PUFR 1,25-(OH)2D NSB 1 lahvička po 3 ml
KALIBRÁTOR 1,25-(OH)2D 0 1 lahvička po 20 ml
KALIBRÁTOR 1,25-(OH)2D3 1-5 5 lahviček po 3 ml
ANTISÉRUM 1,25-(OH)2D 1 lahvička po 35 ml
125 I 1,25-(OH)2D3 1 lahvička po 10 ml
PŘÍPRAVNÝ ROZTOK 1,25-(OH)2D3 1 lahvička po 50 ml
PRECIPITAČNÍ SLOŽKA 1,25-(OH)2D GAR 2 lahvičky po 35 ml
KONTROLNÍ SÉRUM 1,25-(OH)2D 2 lahvičky po 3 ml
95% ETANOL 1 lahvička po 7 ml
Počet testů 100
UCHOVÁVÁNÍ: Po přijetí je nutno soupravu uchovávat při teplotě 2-8 °C. Po otevření
skladujte jednotlivé reagens při 2-8 °C až do doby exspirace, uvedené na označení.
Reagens nelze použít po uplynutí data exspirace. Datum exspirace soupravy je
uvedeno na vnějším označení a odpovídá datu exspirace izotopového indikátoru.
Při rekonstituci obsahu lahviček míchejte šetrně, aby nedocházelo k napěnění.
Rekonstituovaná reagens skladujte při teplotě -15 °C nebo nižší až do doby
bezprostředně před použitím. Reagens z různých šarží se nesmí navzájem
kombinovat.
4.1 Pufr 1,25-(OH)2D NSB: Reagens připravené k použití.
Želatinový pufr s fosforečnanem draselným, obsahující ProClin® 300 (< 0,2 %).
4.2 Kalibrátor 1,25-(OH)2D 0: Reagens připravené k použití.
Fosfátový pufr obsahující proteiny z hovězího séra a ProClin® 300 (< 0,2 %).
4.3 Kalibrátory 1,25-(OH)2D3 (1-5): Lyofilizované reagens.
Pět lyofilizovaných kalibrátorů 1,25-(OH)2D3 v koncentracích od 5 do 200 pg/ml,
obsahujících lidské sérum a ProClin® 300 (<0,2 %). Rekonstituujte každý kalibrátor za
použití 3,0 ml kalibrátoru nuly. Přesná koncentrace je vytištěna na štítcích lahviček.
Kalibrátory soupravy jsou kalibrovány pomocí UV kvantifikace. Kalibrátory soupravy
demonstrují komutativnost pacientských vzorků při použití reagens a operačních
postupů v těchto diagnostických testech in vitro podle uvedeného doporučení.
4.4 Antisérum 1,25-(OH)2D: Reagens připravené k použití.
Sérum s králičími protilátkami proti 1,25-(OH)2D, ředěné fosfátovým želatinovým
pufrem obsahujícím ProClin® 300 (< 0,2 %).
4.5 125 I 1,25-(OH)2D3 : Reagens připravené k použití.
Analog 1,25-(OH)2D3 značený radioaktivním jódem, rozpuštěný ve fosfátovém pufru s
etylénglykolem.
4.6 Přípravný roztok 1,25-(OH)2D3: Reagens připravené k použití.
Pufr s fosforečnanem draselným.
4.7 Kontrolní vzorky 1,25-(OH)2D: proužek 1 (normální), proužek 2 (zvýšený):
Reagens připravené k použití. Zpracované sérum ze směsi jednotek, obsahující
ProClin® 300 (<0,2 %), s přídavkem příslušného množství 1,25-(OH)2D k získání
kontrolních koncentrací v rámci specifikovaných rozsahů. Kontrolní vzorek 1 je v
normálním rozsahu, kontrolní vzorek 2 je ve zvýšeném rozsahu. Rozmezí koncentrací
každého kontrolního vzorku je uvedeno na osvědčení o analýze a představuje limity
stanovené společností DiaSorin pro hodnoty kontrolních vzorků, které lze získat
pomocí spolehlivých stanovení.
106
4.8 Precipitační komplex (kozí protikráličí protilátky – GAR) Lyofilizované reagens.
Normální králičí sérum s přípravnou precipitací pomocí kozího protikráličího antiséra a
polyetylenglykolu (PEG) je rozpuštěno v BSA-boritanovém pufru s přídavkem 0,1 %
azidu sodného a dalších konzervačních látek (lyofilizované). Obsah lahvičky
rekonstituujte 35 ml destilované nebo deionizované vody, důkladně promíchejte, až se
suspenze vidině zhomogenizuje, a potom nechejte stát minimálně 30 minut při
pokojové teplotě; občas promíchejte.
4.9 95% Ethanol: Reagens připravené k použití.
95 % etanol a 5 % voda.
POZNÁMKA: Tento postup vyžaduje také použití patron C18OH. Tyto patrony se
musí objednat zvlášť pod objednacím číslem DiaSorin 65101E.
5. VAROVÁNÍ A ZVLÁŠTNÍ OPATŘENÍ
PRO DIAGNOSTICKÉ ÚČELY IN VITRO
Není určeno k vnitřnímu ani vnějšímu použití u lidských pacientů ani u zvířat.
UPOZORNĚNÍ: Tento test mohou přijímat, pořizovat, vlastnit a používat pouze lékaři,
klinické laboratoře, nemocnice nebo výzkumná zařízení. Testy smí provádět pouze
příslušně kvalifikovaný a vyškolený zdravotnický personál.
REAGENS OBSAHUJÍ MATERIÁL LIDSKÉHO PŮVODU
Nakládejte s nimi, jako by byla potenciálně infekční.
Každá jednotka séra/plazmy jednoho dárce, použitá při přípravě tohoto výrobku, byla
testována metodou schválenou FDA USA a bylo zjištěno, že je nereaktivní na přítomnost
HbsAg, protilátek proti HCV a protilátek proti HIV1/2. Ačkoli jsou tyto metody velmi přesné,
nezaručují, že budou detekovány všechny infikované jednotky. Tento výrobek rovněž
může obsahovat další materiál lidského původu, pro který neexistuje schválený test.
Vzhledem k tomu, že žádná známá testovací metoda nemůže nabídnout úplnou jistotu, že
výrobek neobsahuje virus hepatitidy B, virus hepatitidy C (HCV), virus lidské
imunodeficience (HIV) ani další infekční agens, je nutné se všemi výrobky, které obsahují
materiál lidského původu, nakládat v souladu se správnou laboratorní praxí a používat
vhodná bezpečnostní opatření popsaná v manuálu středisek pro kontrolu a prevenci
onemocnění či národních ústavů zdraví „Biologická bezpečnost v mikrobiologických
a biomedicínských laboratořích“ (Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories), 4. vydání, květen 1999, nebo současné vydání.
REAGENS OBSAHUJÍCÍ AZID SODNÝ
POZOR: Některá reagens v této soupravě obsahují azid sodný. Azid sodný může
reagovat s olověným a měděným potrubím za vzniku vysoce výbušných azidů kovů. Při
likvidaci propláchněte odpadní potrubí velkým množstvím vody, aby nedocházelo k
hromadění azidu. Další informace najdete v příručce pro řízení bezpečnosti
„Dekontaminace laboratorních odpadních potrubí k odstranění solí azidů“
(Decontamination of Laboratory Sink Drains to Remove Azide Salts) č. CDC-22 vydané
Střediskem pro kontrolu a prevenci, Atlanta, GA, USA; 1976.
Rizikové věty nebezpečných látek podle Evropského společenství (Směrnice
Rady 1999/45/EC)
R20/21/22 – Zdraví škodlivý při vdechování, styku s kůží a při požití.
R32 – Uvolňuje vysoce toxický plyn při styku s kyselinami.
S28 – Při styku s kůží okamžitě omyjte velkým množstvím vody.
REAGENS S OBSAHEM ALKOHOLU
Rizikové věty nebezpečných látek podle Evropského společenství (Směrnice
Rady 1999/45/EC)
R11 – Vysoce hořlavý.
S16 – Chraňte před otevřeným ohněm. Zákaz kouření.
S43 – V případě požáru použijte suché chemické hasivo nebo oxid uhličitý.
107
REAGENS OBSAHUJÍCÍ JÓD-125
Tato souprava obsahuje radioaktivní materiál v dávce nepřevyšující 5,5 μCi (204 kBq)
jódu-125. Při uskladnění tohoto materiálu, manipulaci s ním a jeho likvidaci se musí
používat příslušná opatření a zásady správné laboratorní praxe.
Pro lékaře a instituce přijímající radioizotopy v rámci obecné licence:
Tento radioaktivní materiál mohou přijímat, vlastnit a používat pouze lékaři, veterinární
lékaři v rámci veterinární praxe, klinické laboratoře nebo nemocnice, a to výhradně pro
účely klinických nebo laboratorních testů in vitro, které nezahrnují vnitřní ani vnější
podání tohoto materiálu ani radiace z něj vycházející lidským pacientům ani zvířatům.
Přijetí, pořízení, vlastnění, použití a transport tohoto materiálu podléhá předpisům a
všeobecné licenci komise pro jadernou kontrolu (Nuclear Regulatory Commission)
USA nebo státu, se kterým tato komise uzavřela dohodu o uplatňování regulačních
předpisů.
1. Skladování radioaktivního materiálu se musí omezovat pouze na určený prostor.
2. Přístup k radioaktivnímu materiálu může mít pouze oprávněný personál.
3. Radioaktivní materiál nepipetujte ústy.
4. Při práci v prostorech určených k práci s radioaktivním materiálem nejezte, nepijte
ani nekuřte.
5. V případě rozlití je nutno materiál setřít a potom omýt alkalickým detergentem
nebo roztokem k radiologické dekontaminaci. Veškeré použité sklo se před mytím
s jiným laboratorním sklem musí úplně umýt vodou.
Pro lékaře a instituce přijímající radioizotopy v rámci specifické licence:
Přijetí, použití, transport a likvidace radioaktivních materiálů podléhá předpisům a
podmínkám specifické licence.
VAROVÁNÍ: Tento produkt obsahuje chemikálie, které jsou ve státě Kalifornie (USA)
známy jako rakovinotvorné.
POZOR: Hodnoty radioaktivity, uvedené na příbalové informaci v balení, se mohou
mírně lišit od hodnot uvedených na označení krabice a na označení lahvičky s
izotopovým indikátorem. Označení krabice a lahvičky s izotopovým indikátorem
označuje množství radioaktivity k datu kalibrace; příbalová informace v balení označuje
teoretickou radioaktivitu soupravy.
6. INDIKACE MOŽNÉ DETERIORACE REAGENS V SOUPRAVĚ
6.1 Přítomnost pevných neobvyklých částic ve kterémkoli z reagens.
6.2 Změna strmosti nebo posun kalibrační křivky oproti normálním (běžným)
výsledkům.
6.3 Pokles maximální vazby.
6.4 Vysoce nespecifická vazba.
7. ODBĚR A PŘÍPRAVA SÉRA A PLAZMY
Při použití soupravy pro stanovení 1,25-dihydroxyvitamínu D je zapotřebí 500 μl séra
nebo EDTA plazmy k provedení extrakce; objem 1,5 ml umožní opakovanou analýzu a
také bude postačovat k adekvátnímu pipetování.
S touto soupravou lze použít lidské sérum nebo plazmu. S tímto testem lze použít
antikoagulant EDTA. Doporučuje se použít vzorky odebrané nalačno, není to však
nutné. Odběr krve se musí provést aseptickou venepunkcí do 5 ml nebo 10 ml
evakuované skleněné zkumavky.
Pro separaci séra nechejte krev vysrážet při pokojové teplotě (15-25 °C). Centrifugujte
15 minut přibližně při 760 x g* pro získání séra bez produktů hemolýzy. Pro zachování
integrity vzorku není nutné přidání konzervačních látek ani přísad. Veškeré plasty, sklo
a další materiál, které přicházejí do styku se vzorkem, musí být bez jakékoli
kontaminace.
108
Vzorky séra nebo plazmy skladujte při teplotě -15 °C nebo nižší. Vzorky se nesmí
opakovaně zmrazovat a rozmrazovat. Nicméně studie provedená firmou Diasorin
ukázala, že po 3 cyklech zmrazení a rozmrazení vzorky nevykazují žádné podstatné
změny. Testy skladování vzorků, provedené firmou Diasorin, neukázaly žádné
podstatné změny po skladování po dobu 6 měsíců při teplotě -15 °C nebo nižší.
8. POTŘEBNÝ MATERIÁL A VYBAVENÍ, KTERÉ NEJSOU SOUČÁSTÍ
DODÁVKY
8.1 Patrony C18OH (24 kusů) se musí objednat zvlášť pod objednacím číslem
DiaSorin 65101E
8.2 Zkumavky z borosilikátového skla, na jedno použití, 12 x 75 mm a 13 x 100 mm
8.3 Stojan na zkumavky
8.4 Fólie Parafilm (nebo ekvivalent) k zakrytí zkumavek
8.5 Držák z pěnového plastu (nebo ekvivalent) k dekantaci
8.6 Odstředivka dimenzovaná na zkumavky 12 x 15 mm a dosahující 1800 x g*.
8.7 Detektor gama záření citlivý na 125I
8.8 Třepačka „vortex“
8.9 Pipetovací zařízení:
a. mikropipetory kalibrované na 75 μl, 300 μl a 500 μl;
b. dispenzory schopné opakovaně dávkovat 50 μl, 300 μl a 500 μl;
c. volumetrické pipety k rekonstituci kalibrátorů, 3,0 ml;
8.10 Destilovaná nebo deionizovaná voda.
8.11 Organická rozpouštědla:
K přípravě a extrakci vzorků budou zapotřebí následující rozpouštědla.
Používejte pouze rozpouštědla v kvalitě pro HPLC.
Žádné z organických rozpouštědel nesmí přijít do styku se sklem mytým
v kyselině nebo s kyselým prostředím.
a. Acetonitril.
b. Metanol.
c. Hexan. (DŮLEŽITÉ UPOZORNĚNÍ: Obsah n-hexanu musí být vyšší než
95 %.)
d. Metylen chlorid (nesmí obsahovat alkohol jako konzervační látku).
e. Izopropanol (2-propanol).
8.12 Doporučené zařízení pro patrony C18OH:
a. Stanice pro zpracování vzorků Vac Elut. Zpracovává 24 kolon najednou.
K dispozici u firem Analytichem International nebo DiaSorin. Při objednání
u firmy DiaSorin použijte objednací číslo 11610.
8.13 Materiál potřebný k sušení vzorků:
a. Plynný dusík.
b. Sušicí trubice s vyhřívacím blokem nebo vodní lázní o teplotě 37 °C
(±2 °C): systém N-EVAP nebo MULTI-VAP – k dispozici u Organomation
Associates (Berlin, MA) nebo Reacti-Vap II a Reacti-Therm III –
k dispozici u Pierce Chemical Company (Rockford, IL).
* g = (1118 x 10-8 ) (poloměr v cm) (ot/min)2
109
9. PŘÍPRAVA ORGANICKÝCH ROZPOUŠTĚDEL PRO KOLONOVOU
EXTRAKCI
POZNÁMKA: Směsi organických rozpouštědel se musí připravit před začátkem
postupu předběžné extrakce.
UPOZORNĚNÍ:
Směsi rozpouštědel připravte podle popisu v TABULCE I; DiaSorin doporučuje připravit
objem 500 ml. Je možno připravit i větší nebo menší objemy, pokud zůstanou
konzistentní proporce. Nicméně objemy musí být dostatečně velké, aby se
minimalizovala chyba měření. Nejlepších výsledků dosáhnete při nezávislém měření
pro každé rozpouštědlo.
UPOZORNĚNÍ:
Podle potřeby použijte destilovanou nebo deionizovanou vodu.
TABULKA I
Příprava rozpouštědla
Směs
rozpuštědel Materiál 1 l 500 ml
Metanol 700 ml 350 ml
70:30 Voda 300 ml 150 ml
Hexan 900 ml 450 ml
90:10 Metylenchlorid 100 ml 50 ml
Hexan 990 ml 495 ml
99:1 IPA 10 ml 5 ml
Hexan 920 ml 460 ml
92:8 IPA 80 ml 40 ml
10. POSTUP PŘEDBĚŽNÉ EXTRAKCE
10.1 Rekonstituujte každý lyofilizovaný kalibrátor za použití 3,0 ml kalibrátoru nuly.
Kalibrátory dobře promíchejte a nechte stát po dobu 15-20 minut, aby se
zajistila úplná rekonstituce. Zmrzlá reagens nechte úplně roztát. Všechna
reagens nechejte temperovat na pokojovou teplotu. Zabraňte zahřátí reagens
na teplotu více než 25 °C. Před použitím všechna reagens dobře promíchejte.
10.2 Napipetujte 500 μl každého kalibrátoru (0-5), kontrolního vzorku a
pacientského vzorku do označených zkumavek z borosilikátového skla o
velikosti 12 x 75 mm.
10.3 Ke každému vzorku přidejte 500 μl acetonitrilu, přerušovaně promíchejte na
třepačce „vortex“ – nejméně 3x po dobu 10 minut.
10.4 Zkumavky centrifugujte při 760 x g* po dobu 10 minut při teplotě 20-25 °C.
10.5 Supernatant slijte do označených zkumavek 12 x 75 mm nebo 13 x 100 mm
(podle preference); tablety zlikvidujte.
* g = (1118 x 10-8 ) (poloměr v cm) (ot/min)2
110
10.6 Do každé zkumavky přidejte 500 μl přípravného roztoku a promíchejte na
třepačce „vortex“.
POZNÁMKA: Tato souprava je určena na 48 extrakcí včetně kalibrátorů a
kontrolních vzorků plus 40 neznámých vzorků. To znamená, že 24 vzorků lze
extrahovat na VacElut okamžitě; zbývající skupina 24 vzorků se může
extrahovat následně. Kolonová extrakce se má provést co nejdříve po přidání
přípravného roztoku. Vzorky extrahované na koloně je možno skladovat
96 hodin při teplotě -15°C nebo nižší.
10.7 Vzorky jsou nyní připraveny k aplikaci na patrony C18OH.
11. POSTUP KOLONOVÉ EXTRAKCE
11.1 Vysvětlení funkce stanice VAC ELUT najdete v návodu k použití tohoto
zařízení. Sestavte stanici podle popisu uvedeného v návodu.
11.2 Označte zkumavky z borosilikátového skla 13 x 100 mm pro každý kalibrátor
(0-5) a pro kontrolní a neznámý vzorek. Zkumavky umístěte do stanice VAC
ELUT. Ujistěte se, že víko stanice VAC ELUT je v poloze „WASTE“ a
zkumavky jsou umístěny tak, aby se v nich shromažďovaly příslušné eluáty.
Patrony C18OH umístěte do víka stanice VAC ELUT.
11.3 Do příslušné patrony přidejte směsi rozpouštědel podle specifikace v
TABULCE II.
DŮLEŽITÉ UPOZORNĚNÍ:
Použití vakua:
Po přidání každého rozpouštědla zapněte vakuum a nechejte směs rozpouštědel
úplně protéci přes patronu; pak teprve pokračujte přidáním dalšího rozpouštědla.
Zapněte a vypněte vakuum v krocích doporučených v TABULCE II (podle
preferencí je možno vakuum vypnout před každým přidáním rozpouštědla).
Vakuum je nutno nastavit na hodnotu 254 mm Hg (10 palců Hg) nebo nižší.
Každou směs rozpouštědel eluujte přes výstupní port „WASTE“ a do příslušné
odpadní nádoby, až do doby, kdy nastane krok finálního odběru.
Aplikace vzorku:
Vzorek lze na patronu buď přímo nalít, nebo nakápnout pipetou.
Mezi aplikacemi nenechejte patrony schnout na vzduchu déle než 5 minut.
Příprava patrony C18OH:
Patrony C18OH je nutno před prvním použitím promýt 5 ml roztoku 90:10 hexanu a
metylenchloridu, 5 ml IPA a 5 ml metanolu. Rozpouštědlový roztok 90:10
hexan/metylenchlorid je možno připravit smícháním 900 ml hexanu a 100 ml
metylenchloridu. Novou, nepoužitou patronu vložte do přístroje VAC ELUT,
nastavte pozici „WASTE“ a přidejte 5 ml roztoku 90:10 hexanu/metylenchloridu a
pak 5 ml IPA do každé kolony a potom 5 ml metanolu. Každou směs rozpouštědel
nechejte úplně projít přes patrony, a pak teprve pokračujte s další směsí. Po této
počáteční přípravě nebude nutné tento krok opakovat, jelikož patrony budou
regenerovány během procesu extrakce.
POZNÁMKA: Mají-li se extrahovat další vzorky (více než 24), regenerujte patrony
za použití metody specifikované v TABULCE II. Patrony lze použít opakovanì
(maximálnì 30x).
POZNÁMKA: Materiál patrony C18OH je přidržován na místě pomocí frity z
porézních vláken. Patrony s uvolněnými nebo chybějícími fritami zlikvidujte,
protože může chybět materiál C18OH.
111
TABULKA II
Popis a analýza extrakce Kroky extrakce Manipulace s
eluentem
1. Přidjete 1 ml metanolu;
zapněte vakuum.
Příprava/regenerace kolony.
Odstraňuje: interferující látky z
předchozího použití (krok 1)
2. Vypněte vakuum.
Zlikvidujte
„WASTE“
Aplikace vzorku
3. Aplikujte všechny vzorky,
zapněte vakuum. Z kroku 10
postupu předběžné extrakce.
Zlikvidujte
„WASTE“
Purifikace/odstranění
metabolitů vitamínu D
4. Přidjete 5 ml roztoku 70:30
metanolu a deionizované
nebo destilované vody.
Odstraňuje: interferující polární lipidy,
soli a pigmenty (krok 4)
5. Přidjete 5 ml roztoku hexanu
a metylenchloridu 90:10.
25(OH)D (krok 5) 6. Přidjete 5 ml roztoku hexanu
a izopropanolu 99:1.
Zbývající 25(OH)D a 24,25(OH)2
D/25,26(OH)2 D (krok 6) 7. Vypněte vakuum.
Zlikvidujte
„WASTE“
Odbìr 1,25-(OH)2D DÙLEŽITÉ UPOZORNÌNÍ!
Eluce purifikovaného 1,25-(OH)2D
(krok 9) 8. Přidjete Vac Elut do polohy
„Collect“.
9. Přidjete 3 ml roztoku hexanu
a izopropanolu 92:8. Zapněte
vakuum.
10. Vypněte vakuum.
„COLLECT“
12. SUŠENÍ A REKONSTITUCE ELUÁTŮ
12.1 Zkumavky obsahující eluáty uložte do vyhřívacího bloku nebo vodní lázně a
sušte při 37 °C (±2 °C).
12.2 Eluáty sušte v digestoři pod ochrannou atmosférou dusíku při tlaku 2-4 psi
(doba sušení 20-30 minut).
12.3 Okamžitě po vysušení eluátu zkumavky vytáhněte.
12.4 Každý z vysušených extraktů rekonstituujte 50 μl 95% etanolu; jemně
promíchejte na třepačce „vortex“ při nízké nebo střední rychlosti. Do stejných
zkumavek obsahujících 50 μl 95 % etanolu přidejte 125 μl izotopového
indikátoru a opět jemně promíchejte na třepačce „vortex“ při nízké nebo
střední rychlosti. POZNÁMKA: Kroky promíchávání na třepačce „vortex“ jsou
velmi důležité, protože zajišťují správnou rekonstituci vzorku, což je důležité
pro dosažení dobré přesnosti. UPOZORNĚNÍ: Vír udržujte v dolní části
zkumavky, aby nedocházelo ke ztrátě objemu vzorku a aby byl zajištěn
dostatečný objem k pipetování v průběhu testu. Označte jednu další
zkumavku pro celkový výsledek (Total Count – TC) a jednu zkumavku pro
NSB. Do obou zkumavek přidejte 50 μl 95 % etanolu a 125 μl izotopového
indikátoru. Použijí se k vytvoření duplicitních zkumavek TC a NSB pro
sestavení testu.
112
12.5 Test proveďte okamžitě po rekonstituci vzorků. Nejlepších výsledků u větších
testů dosáhnete při rekonstituování 12-15 vzorků najednou a jejich
napipetování do testu předtím, než se provede rekonstituce dalších 12-
15 vzorků.
13. POSTUP STANOVENÍ
13.1 Vytvořte sadu označených zkumavek na jedno použití z borosilikátového skla
12 x 75 mm, a to pro každý kalibrátor (0-5) a pro kontrolní a neznámý vzorek
podle schématu testu. Opatrně přidejte 75 μl rekonstituovaného extraktu
kalibrátoru, kontrolního vzorku a vzorku do duplicitních testovacích zkumavek.
UPOZORNĚNÍ: Tento krok se musí provést opatrně, protože v každé
zkumavce je pouze 25 μl navíc.
13.2 Viz krok číslo 4, „Sušení a rekonstituce eluátů“. Přidejte 75 μl ze zkumavky TC
do duplicitních testovacích zkumavek. Opakujte tento krok také pro duplicitní
testovací zkumavky NSB.
13.3 Do zkumavek NSB přidejte 300 μl pufru NSB.
13.4 Přidejte 300 μl primární protilátky do všech zkumavek kromě zkumavek TC a
NSB.
13.5 Dobře promíchejte a inkubujte 2 hodiny (±15 minut) při 20-25 °C.
POZNÁMKA: Rekonstituujte precipitační složku GAR přidáním 35 ml
destilované nebo deionizované vody, důkladně promíchejte, až se suspenze
vidině zhomogenizuje, a potom nechejte stát minimálně 30 minut při
pokojové teplotě; před použitím a během použití občas promíchejte.
13.6 Přidejte 500 μl dobře promíchané precipitační složky GAR do všech zkumavek
kromě zkumavek TC. Inkubujte 20 minut (±5 minut) při 20-25 °C.
13.7 Všechny zkumavky kromě zkumavek TC centrifugujte 20 minut při 20-25 °C a
při 1800 x g*.
13.8 Slijte všechny supernatanty (kromě zkumavek TC) za použití držáku z
pěnového plastu nebo ekvivalentního zařízení tak, že držák obrátíte do
příslušné nádoby na odpad. Obrácený držák umístěte na absorpční papír na
dobu 2-3 minuty. Zkumavky jemně osušte, aby se odstranila veškerá kapalina.
13.9 Změřte radioaktivitu všech zkumavek po dobu 1 minuty pomocí detektoru
gama záření. Měření detektorem musí trvat minimálně 1 minutu (viz odstavec
Omezení postupu).
14. POZNÁMKY K POSTUPU
14.1 Poměrný díl reagens přidávejte do dolní třetiny testovací zkumavky, aby se
reagens dokonale promísila.
14.2 Správný podíl rozpouštědla má zásadní důležitost pro dobrou výtěžnost.
Objemy připravte dostatečně velké, aby se minimalizovala chyba měření.
14.3 Pokud je naměřená hodnota některého vzorku vyšší než nejvyšší kalibrátor,
musí se analyzovat znovu a před extrakcí se musí zředit kalibrátorem ze
soupravy. Výsledek se musí vynásobit příslušným dilučním faktorem. Příklad:
Smíchejte 500 μl vzorku s 500 μl kalibrátoru nuly, potom testujte 500 μl této
směsi podle příbalové informace produktu.
14.4 Po průměrnou dobu provedení 100 testů nebyl pozorován žádný posun hodnot
testu.
* g = (1118 x 10-8 ) (poloměr v cm) (ot/min)2
113
14.5 V zájmu kompletnosti monitorování konzistence funkce testu RIA musí
laboratoř sledovat a kontrolovat ještě další faktory. Firma DiaSorin navrhuje
pravidelné kontroly následujících parametrů k zajištění konzistentní funkce
soupravy.
a. Celkové výsledky (TC)
b. Maximální vazba
Průměrný počet částic za minutu (CPM) zkumavek s nulovým
kalibrátorem / průměrná hodnota CPM zkumavek TC.
c. Nespecifická vazba
Průměrný počet částic za minutu (CPM) zkumavek NSB / průměrná
hodnota CPM zkumavek TC.
d. Strmost kalibrační křivky
Je možno sledovat 50% potlačení.
15. ŘÍZENÍ JAKOSTI
K monitorování funkce testu musí každá laboratoř při každém testu použít nejméně dva
kontrolní vzorky (jeden kontrolní vzorek s normálním rozsahem a jeden kontrolní
vzorek se zvýšeným rozsahem). Lze použít komerčně dostupné kontrolní vzorky nebo
dva referenční vzorky dodané se soupravou.
S kontrolními vzorky je nutno zacházet jako s neznámými vzorky a musí se testovat
duplicitně. Laboratoř musí pořizovat a uchovávat grafy řízení kvality, které dokumentují
funkci kontrolních vzorků. Přijané limity funkčnosti je nutno určit pro každou
individuální laboratoř pro každou úroveň kontroly pomocí statistických metod určených
k detekci náhodných i systémových chyb. Kontrolní výsledky musí splňovat kritéria
laboratoře co se týče přijanosti před hlášením výsledků testů pacientů.12,13,14
16. VÝPOČET VÝSLEDKŮ
Existuje mnoho metod výpočtu výsledků testů RIA. Všechny jsou založeny na získání
kalibrační křivky zakreslením rozsahu vazby v závislosti na stanovených koncentracích
kalibrátorů. Tento graf může být v lineárních nebo logaritmických souřadnicích. Každá
z těchto metod poskytuje v zásadě stejné hodnoty kontrolních vzorků a vzorků, ačkoli
některé testy se mohou lépe „hodit“ pro jednu metodu, a jiné pro druhou. Metoda
výpočtu kontrolní laboratoře firmy DiaSorin je metoda závislosti %B/B0 na
logaritmickém průběhu koncentrace, založená na aproximačním programu Spline
Smoothed Curve.
16.1 Výpočet procenta B/B0
a. Vypočítejte průměrnou hodnotu CPM pro každý kalibrační, kontrolní a
neznámý vzorek.
b. Odečtěte průměrnou hodnotu CPM od hodnot pro zkumavky NSB pro
všechna měření.
c. Průměrnou korigovanou hodnotu CPM pro každý kalibrátor, kontrolní
vzorek nebo neznámý vzorek podělte průměrnou korigovanou hodnotou
CPM nulového kalibrátoru a vynásobte 100.
Průměr CPM (kalibrátor nebo neznámý vzorek) –
průměr CPM (NSB)
Průměr CPM (kalibrátor 0) - průměr CPM (NSB)
x 100 = B/B0 (%)
16.2 Použití grafu kalibrační křivky
a. Za použití 2 fázového papíru „log/logit“ nebo semilogaritmického papíru
zakreslete procentuální B/B0 (%) pro kalibrátory 1,25 (OH)2D na osu Y a
koncentraci kalibrátoru na osu X.
114
POZNÁMKA: K analýze dat lze také použít programy na automatickou
redukci dat. Firma DiaSorin používá systém Multi-Calc (Pharmacia) s
programem LIN-LOG smooth-SPLINE fit. Další metody redukce dat se
musí před začleněním do normálního použití validovat.
b. Body spojte optimální křivkou.
c. Interpolujte koncentrace 1,25-(OH)2D ve vzorcích z grafu kalibrátorů.
d. Pokud byl některý z neznámých vzorků zředěn, proveďte korekci podle
příslušného dilučního faktoru.
e. Rozsah detekce tohoto testu je 5,0 pg/ml až 200 pg/ml. Jakákoli hodnota
nižší, než je nejnižší hodnota kalibrátoru 5,0 pg/ml, je extrapolovaná
hodnota a může se hlásit jako „méně než 5 pg/ml“.
f. Vypočítejte maximální vazbu dělením CPM nulového kalibrátoru
průměrným celkovým výsledkem získaným pro zkumavky TC.
Typická data vzorku pro 1,25-(OH)2D RIA ukazuje TABULKA IV a OBRÁZEK 1; tyto
informace jsou pouze referenční a nesmí se používat pro výpočet žádného výsledku.
TABULKA IV
Vzorová data testu DiaSorin 1,25-(OH)2D RIA
Zkumavka
Duplicitní
CPM
Průměrný
CPM
Korigovaný
CPM
Procento
navázaných
(B/T)
Procent
(B/B0)
Konc.
(pg/ml)
Celkový výsledek 40792 40685
40578
NSB 1438 1439 3,5
1439
Kalibrátor 0 18006 18063 16624 44,4 100,0
18119
Kalibrátory
(pg/ml)
1 (5,0) 16710 16740 15302 92,0
16770
2 (15,0) 14941 14929 13490 81,2
14916
3 (30,0) 13087 13106 11667 70,2
13124
4 (75,0) 9820 9793 8354 50,2
9765
5 (200) 6412 6438 5000 30,0
6464
Kontrolní vzorky
Proužek 1: 13275 13403 11964 72,0 27,3
normální rozsah 13530
Proužek 2: 8206 8165 6727 40,5 119
zvýšený rozsah 8124
115
Vzorová kalibrační křivka testu DiaSorin 1,25-(OH)2D RIA
OBRÁZEK 1
REDUKCE DAT
Laboratoř kontroly kvality firmy DiaSorin používá program pro aproximaci a vyhlazení
křivky.
17. OMEZENÍ POSTUPU
17.1 Doba detekce musí být dostatečně dlouhá, aby se zamezilo zanesení chyby v
důsledku neúčinnosti detektoru (např. při akumulaci 2000 CPM bude
chyba 5 %, při 10000 CPM bude chyba 1 %).
17.2 Při rozhodování o léčbě jednotlivých pacientů je nutné, aby kliničtí lékaři
využívali výsledky testů společně s dalšími klinickými a laboratorními údaji.
17.3 Výkonnostní charakteristika tohoto testu nebyla stanovena pro pediatrické
pacienty.
18. PŘEDPOKLÁDANÉ HODNOTY
Referenční interval pro normální dárce
Je důležité, aby každá laboratoř stanovila svůj vlastní referenční interval, který je
reprezentativní pro její typickou populaci. Nicméně v rámci klinické studie prováděné
na třech pracovištích během letních a podzimních měsíců byly u 123 zjevně zdravých
dobrovolníků ze tří měst na americkém Středozápadě zjišťovány hodnoty 1,25-(OH)2D.
Skupinu těchto 123 zdravých dárců tvořily rasově různorodé množiny 37 mužů a
86 žen ve věku od 21 do 68 let. Střední hodnota 1,25-(OH)2D celého vzorku (n=123)
byla 43,9 pg/ml. 95% referenční interval odhadnutý neparametrickou metodou (podle
směrnice CLSI C28-A215) byl 25,1-66,1 pg/ml.
Pacienti s chronickým selháním ledvin
Byla provedena klinická studie k vyhodnocení hladiny 1,25-(OH)2D u dospělých
pacientů, u nichž bylo diagnostikováno chronické selhání ledvin. Byl sestaven a
testován vzorek 87 dobrovolníků s tímto onemocněním (49 mužů, 38 žen, ve věku od
19 do 84 let) z amerického Středozápadu. Zjištěný rozsah hodnot 1,25-(OH)2D tohoto
vzorku (n=87) byl 1,6-17,3 pg/ml. 95% horní referenční limit odhadovaný
neparametrickou metodou je 14,2 pg/ml.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 10 100 1000
pg/mL
% B/Bo
116
19. SPECIFICKÉ CHARAKTERISTIKY ÚČINNOSTI
19.1 Přesnost
Přesnost testu hodnotila firma DiaSorin na základě principů stanovených ve směrnici
CLSI EP5-A.16 Byly testovány tři kontrolní hladiny vzorků lidského séra s koncentracemi
1,25-(OH)2-D rozloženými v rozsahu testu po 25 testovacích dnů, což znamenalo více
než 60 pracovních dnů. Do studie bylo zahrnuto více laboratorních pracovníků a více
dávek všech komponent. Kombinované výsledky byly vyhodnoceny variantní analýzou
(ANOVA) a jsou uvedeny v následující tabulce.
V rámci testu Mezi dny Celkem
Vzorek N
Střední
hodnota
pg/ml S.D. %CV S.D. %CV S.D. %CV
Nízká 25 25,8 1,76 6,8 3,8 14,6 4,0 15,3
Střední 25 41,3 3,16 7,7 4,6 11,1 5,1 12,3
Vysoká 25 105,2 11,86 11,3 11,8 11,2 14,4 13,7
19.2 Spolehlivost: Spolehlivost stanovení byla ověřena pomocí testu linearity
a testu výtěžnosti.
Linearita (paralelnost)
Firma DiaSorin hodnotila linearitu ředění podle doporučení směrnice CLSI EP6-P.17
Byly připraveny tři směsi jednotek séra pacientů sériovým ředěním pomocí nulového
kalibrátoru; poměrné díly pak byly jednotlivě zmraženy na –20 °C. Jednotlivé vzorky a
ředění byly analyzovány ve více replikátech ve třech různých termínech provedení
testu. Byly určeny předpokládané hodnoty podle neředěných vzorků směsi jednotek,
jejichž hodnoty byly vynásobeny dilučním faktorem. Získaná data jsou souhrnně
uvedena níže a sloučené výsledky jsou zakresleny jako lineární regrese
předpokládaných versus naměřených hodnot.
Vzorek č. Ředění
Předpokládaná
hodnota (pg/ml)
(N=10)
Střední naměřená
hodnota (pg/ml)
(N=10)
NEŘEDĚNÉ 49,6 49,6
1:2 24,8 25,3
1:4 12,4 11,1 1
1:8 6,2 4,4
NEŘEDĚNÉ 50,2 50,2
1:2 25,1 24,2
1:4 12,6 12,2 2
1:8 6,3 4,6
NEŘEDĚNÉ 62,0 62,0
1:2 31 31,9
1:4 15,5 13,4 3
1:8 7,8 6,2
117
Výtěžnost
Byla hodnocena míra kvantitativní výtěžnosti testu, tj. schopnost získání veškeré
analyzované látky přítomné v klinickém vzorku, a to přidáním různých množství čerstvě
připraveného čistého antigenu proti 1,25-(OH)2-D do třech směsí jednotek. Byly
zvoleny a duplicitně analyzovány tři koncentrace a byla stanovena procentuální
výtěžnost. Průměrné procento výtěžnosti stanovené touto metodou bylo 101 %.
Vzorek č.
Poč.
konc.(pg/ml)
1,0 ml
Přidané
množství
(pg)
*Předpokl.
(pg/ml)
Naměřené
(pg/ml)
%
Výtěžnost
50,0 77,7 75,6 97
1 30,8 62,5 88,9 87,2 98
75,0 99,8 103 103
50,0 89,2 89,5 100
2 42,8 62,5 100,3 98,9 99
75,0 111,0 118 106
50,0 86,8 83,9 97
3 40,3 62,5 97,9 103 105
75,0 108,8 118 108
*Výpočet předpokládané koncentrace zahrnuje diluční faktor zavedený přidaným
roztokem.
19.3 Analytická citlivost
Bylo zjištěno, že citlivost tohoto testu, definovaná jako nejnižší množství odlišiné od
nuly při dvojnásobku odchylky kalibrátoru pod střední hodnotu cpm kalibrátoru nuly
(n=20), je <2,0 pg/ml.
19.4 Analytická specificita
Údaje o zkřížené reaktivitě antiséra použitého v této soupravě jsou vyjádřeny jako
poměr koncentrace 1,25-(OH)2D3 ke koncentraci zkříženě reagující látky při 50%
potlačení maximální vazby.
Analyzovaná látka Konc. při 50% B/Bo Zkřížená reaktivita %
24,25 D3 76420 pg/ml <0,5
25,26 D3 24330 pg/ml <0,5
25 D3 >>>1 mg/ml <0,5
19.5 Interferující látky
Byla provedena studie interference ke zjištění, zda zvýšené úrovně obecných
endogenních látek mohou negativně ovlivnit výsledky testu. Toto hodnocení bylo
konzistentní se směrnicemi CLSI (EP7-P).18 Byly testovány tři vzorky lidského séra,
obsahující nízkou, střední a vysokou hladinu 1,25-(OH)2-D3, a to buď s přidáním
testované látky, nebo jako kontrolní vzorky, do nichž byl přidán identický objem
vehikula testované látky. Každý vzorek by extrahován dvakrát a byly vytvořeny čtyři
replikáty. Níže uvedené výsledky demonstrují, že žádná z testovaných látek
nezpůsobuje u testovaných kontrolních vzorků interferenci podle statistického testování
ANOVA (95% interval spolehlivosti) ani podle střední hodnoty vzorků s přidanou látkou
převyšujících ± 2 odchylky rozsahu kalibrátoru.
118
Bilirubin
Vzorek č.
Stř. hodn.
kontrol. vz.
(pg/ml)
Rozsah 2 SD
kontr. vz.
Stř. h.
bilirubin
(pg/ml)
Interference
ANOVA
Nízká 19,9 18,5-21,3 19,5 0,54
Střední 31,7 27,7-35,7 29,9 0,22
Vysoká 79,7 63,5-95,9 83,2 0,45
Cholesterol
Vzorek č.
Stř. hodn.
kontrol. vz.
(pg/ml)
Rozsah 2 SD
kontr. vz.
Stř. h.
cholesterol
(pg/ml)
Interference
ANOVA
Nízká 19,9 18,5-21,3 19,4 0,64
Střední 31,7 27,7-35,7 29,7 0,15
Vysoká 79,7 63,5-95,9 75,2 0,40
Triglyceridy
Vzorek č.
Stř. hodn.
kontrol. vz.
(pg/ml)
Rozsah 2 SD
kontr. vz.
Stř. h.
triglyceridy
(pg/ml)
Interference
ANOVA
Nízká 14,7 12,9-16,5 15,1 0,88
Střední 30,4 22,4-38,4 33,4 0,25
Vysoká 92,6 69,5-116,9 95,4 0,68
Hemoglobin
Vzorek č.
Stř. hodn.
kontrol. vz.
(pg/ml)
Rozsah 2 SD
kontr. vz.
Stř. h.
hemoglobin
(pg/ml)
Interference
ANOVA
Nízká 21,5 17,5-25,5 20,8 0,53
Střední 38,6 35,4-41,8 40,0 0,43
Vysoká 112,7 101,4-124,0 120,6 0,17
Močovina
Vzorek č.
Stř. hodn.
kontrol. vz.
(pg/ml)
Rozsah 2 SD
kontr. vz.
Stř. h.
močovina
(pg/ml)
Interference
ANOVA
Nízká 25,1 20,9-29,3 26,6 0,39
Střední 36,2 23,8-48,6 35,9 0,96
Vysoká 120,1 97,4-142,8 118,6 0,82
SEZNAM LITERATURY VIZ POSLEDNÍ STRANA
119
SCHÉMA ANALÝZY
1. Kalibrátory, kontrolní vzorky a neznámé vzorky se po vysušení na koloně
rekonstituují 95% etanolem a izotopovým indikátorem.
3. Reagens dávkujte podle následujícího schématu:
Zkumavky/reagens
Celkové
výsledky NSB
Kal.
0-5
Kontrolní a
neznámé vzorky
Rekonstituované kalibrátory - - 75 μl -
Rekonstituované kontrolní a
neznámé vzorky - - - 75 μl
95% etanol a izotopový
indikátor**
75 μl 75 μl - -
Pufr NSB - 300 μl - -
Antisérum 1,25-(OH)2-D - - 300 μl 300 μl
POZNÁMKA: Zkumavky TC a NSB se vytvoří přidáním 50 μl 95% etanolu se 125 μl
izotopového indikátoru a napipetováním 75 μl této směsi do duplicitních testovacích
zkumavek.
3. Dobře promíchejte a inkubujte 2 hodiny (±15 minut) při 20-25 °C.
4. Přidejte 500 μl precipitační složky GAR do všech zkumavek kromě zkumavek TC.
5. Dobře promíchejte a inkubujte 20 minut (± 5 minut) při 20-25 °C.
6. Centrifugujte při 1800 x g* po dobu 20 minut při teplotě 20-25 °C.
7. Slijte supernatanty.
8. Každou zkumavku změřte detektorem gama záření po dobu 1 minuty.
*g = (1118 x 10-8)(poloměr v cm)(ot/min)2
120
1,25-DIHYDROKSYVITAMIN D 125I RIA-Kit
1. BRUKSOMRÅDE
FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK.
1,25-dihydroksyvitamin D 125I RIA er en radioimmunoanalyse basert på kompetitiv
likevekt og beregnet på den kvantitative determinasjonen av 1,25-dihydroksyvitamin D
(1,25-(OH)2-D) i humant serum eller EDTA-plasma. Den skal brukes til å vurdere 1,25-
(OH)2-D-mangel relatert til nyresykdom. Analyseresultater skal brukes i sammenheng
med øvrige kliniske data og laboratoriedata for å hjelpe klinikeren med å ta
beslutninger om individuell pasientstyring i voksne pasientpopulasjoner.
2. SAMMENDRAG OG FORKLARING
D-vitaminet kommer fra 2 kilder: eksogent (fra føden) og endogent (biosyntese, regulert av
eksponering for ultrafiolett lys). Den eksogene eller næringsmessige kilden omfatter
matvarer med naturlig lave nivåer D-vitamin2 (f.eks. melk, smør, frokostblanding tilsatt
D-vitamin2 ), kosttilskudd i form av reseptfrie vitaminer samt reseptbelagte medikamenter
med D2 -vitaminer.1 D-vitamin har i seg selv ingen aktivitet når det kommer inn i
blodsirkulasjonen fra føden eller den fotokjemiske prosessen. Biologisk aktivitet oppnås
først etter en kompleks serie metabolske trinn.2
Man vet nå at den metabolske aktiveringen av D-vitamin reguleres på en komplisert måte,
og i høy grad påvirkes av variabler som kalsium- og fosfor i kosten, graden
D-vitaminmangel, genetisk betingede mangler, konsentrasjonen av parathormon,
eksponering for ultrafiolett lys og nyrefunksjonen.3 Biosyntesen av de dihydroksylerte
formene av D-vitamin3 begynner med at ultrafiolett sollys virker på 7-dehydrokolesterol slik
at D-vitamin3 dannes i huden. Når D-vitamin3 kommer inn i sirkulasjonen tas det raskt opp
av leveren, der det metaboliseres til25-hydroksyvitamin D3 (25-OH-D3). Leveren vil også
hydrolyksere D-vitamin2 fra føden til 25-hydroksyvitamin D2 (25-OH-D2).2,4
Etter hydroksyleringen i leveren bindes 25-OH-D til D-vitaminbindende proteiner og
transporters til nyren, der ytterligere hydrolyksering finner sted. Tillegget av et hydroksyl
på posisjon 1 danner 25-dihydroksyvitamin D (1,25-(OH)2-D). 1,25-dihydroksy-vitamin D
er den mest potente naturlig forekommende D-vitaminmetabolitten som det kjennes til så
langt, og produksjonen av dette reguleres nøye gjennom serumkonsentrasjonene av
kalsium, fosfot og parathormon. Ved kalsiumbelastning er 1,25-(OH)2-D den viktigste
D-vitaminmetabolitten som dannes i nyren.5,6
Dette kommer av at den spiller en fundamental rolle i den effektive aktive absorpsjonen av
kalsium og fosfor, så vel som i deres normale metabolisme. Målingen av 1,25-(OH)2-D er
derfor raskt i ferd med å bli et effektivt redskap i forskningen av sykdommer og forhold som
påvirker den normale metabolismen av fosfor og kalsium.7,8,9
3. ANALYSEPRINSIPPER
DiaSorin 1,25-(OH)2-D-analysen består av to trinn. Først utføres en forberedende
ekstraksjon og påfølgende rengjøring av D-vitaminmetabolitter fra serum eller EDTAplasma
ved hjelp av C18OH-kassetter.10 Etter ekstrasjonen, analyseres den behandlede
prøven ved hjelp av en kompetitiv RIA-prosedyre. RIA-metoden er basert på et polyklonalt
antistoff som er spesifikt for både 1,25-(OH)2 D2 og 1,25-(OH)2D3. Prøven, antistoffet og
sporstoffet inkuberes i 2 timer ved 20-25°C. Faseseparasjon oppnås ved å inkubere i 20
minutter ved 20-25°C i tilstedeværelsen av et utfellingskompleks med et sekundært
antistoff. Etter sentrifugering og dekantering, les den gjenværende bundne fraksjonen i
pelletten i en gammaler. Verdiene beregnes direkte fra en kalibratorkurve med kjente
konsentrasjoner. Sluttkonsentrasjonen av 1,25-(OH)2D i serum- og EDTA-plasmaprøvene
uttrykkes som pg/mL.
121
4. REAGENSER SOM FØLGER MED KITET
1,25-(OH)2D NSB-BUFFER 1 flaske/3 mL
1,25-(OH)2D KALIBRATOR O 1 flaske/20 mL
1,25-(OH)2D3 KALIBRATOR 1-5 5 flasker/3 mL
1,25-(OH)2D ANTISERUM 1 flaske/35 mL
125 I 1,25-(OH)2D3 1 flaske/10 mL
1,25-(OH)2D3 FORBEHANDLINGSLØSNING 1 flaske/50 mL
1,25-(OH)2D GAR-UTFELLINGSKOMPLEKS 2 flasker/35 mL
1,25-(OH)2D KONTROLLSERUM 2 flasker/3 mL
95 % ETANOL 1 flaske/7 mL
Antall tester 100
OPPBEVARING: Ved mottak skal kitet oppbevares ved 2-8°C. Etter åpning skal hver
reagens oppbevares ved 2-8°C til utløpsdatoen som angis på etiketten. Reagenser må
ikke brukes etter at de er gått ut på dato. Utløpsdatoen på kitet angis på den eksterne
etiketten og tilsvarer utløpsdatoen på flasken med sporstoff.
Når innholdet i flaskene rekonstitueres, må du blande forsiktig for å unngå
skumdannelse. Alle rekonstituerte reagenser må oppbevares ved –15°C eller lavere
umiddelbart etter bruk. Reagenser fra ulike partier må ikke blandes.
4.1 1,25-(OH)2D NSB-buffer: Reagens klar til bruk
Kaliumfosfatgelatinbuffer med ProClin 300 (< 0,2 %).
4.2 1,25-(OH)2D 0-kalibrator: Reagens klar til bruk
Fosfatbuffer med bovine serumproteiner og ProClin 300 (< 0,2 %).
4.3 1,25-(OH)2D3 Kalibratorer (1-5): Lyofiliserte reagenser
Fem lyofiliserte kalibratorer med (1,25-(OH)2D3) ved konsentrasjoner på 5 -200 pg/mL
som inneholder humant serum og ProClin 300 (<0,2 %). Rekonstituer hver kalibrator
med 3,0 mL av kalibrator null. Eksakte konsentrasjoner er angitt på flaskeetikettene.
Kalibratorene i kitet har blitt kalibrert ved hjelp av UV-kvantifisering. Kit-kalibratorene
kan betraktes som likeverdige med pasientprøver når de brukes med reagensene og
operasjonsprosedyren som er anbefalt for denne diagnostiske in vitro-testen.
4.4 1,25-(OH)2D Antiserum: Reagens klar til bruk
Anti-1,25-(OH)2D-serum fra kanin, fortynnet med fosfatgelatinbuffer med ProClin 300
(< 0,2 %).
4.5 125I 1,25-(OH)2D3 Reagens klar til bruk
Radio-jodert 1,25-(OH)2D3-analog fortynnet med etylenglykolfosfatbuffer.
4.6 1,25-(OH)2D3 Forbehandlingsløsning: Reagens klar til bruk
Kaliumfosfatbuffer.
4.7 1,25-(OH)2D-kontroller: Nivå 1 (normalt), Nivå 2 (forhøyet): Reagens klar til
bruk En behandlet serumpool som inneholder ProClin 300 (< 0,2 %), tilsatt egnede
mengder 1,25-(OH)2D for å oppnå kontrollkonsentrasjoner innenfor de angitte
områdene. Kontroll 1 ligger innenfor normalområdet og kontroll 2 ligger innenfor et
forhøyet område. Konsentrasjonsområdene for hver kontroll er angitt på
analysesertifikatet og viser grensene som er fastslått av DiaSorin for kontrollverdier
som kan oppnås i påliige analysekjøringer.
122
4.8 Utfellingskompleks av typen anti-kaninserum fra geit (GAR): Lyofilisert
reagens
Normalt kaninserum, forhåndsutfelt med anti-kaninserum fra geit og polyetylenglykol
(PEG), fortynnes med BSA-boratbuffer med 0,1 % natriumazid og andre
konserveringsmidler tilsatt (lyofilisert). Rekonstituer flaskens innhold med 35 mL
destillert eller avionisert vann. Bland grundig til suspensjonen virker homogen og la den
deretter stå i minst 30 minutter ved romtemperatur. Bland nå og da.
4.9 95 % etanol. Reagens klar til bruk
95 % etanol og 5 % vann.
MERK: C18OH-kassetter kreves også for denne prosedyren. Disse kassettene må
bestilles separat. Angi DiaSorins katalognummer 65101E.
5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER
FOR BRUK TIL IN VITRO-DIAGNOSTIKK.
Ikke avsett for innvortes eller utvortes bruk hos mennesker eller dyr.
FORSIKTIG: Dette produktet skal kun mottas, erverves, eies og brukes av leger,
kliniske laboratorier, sykehus eller forskningsinstitusjoner. Testing skal kun utføres av
laboratoriepersonale med tilstrekkelige kvalifikasjoner og opplæring.
REAGENSER SOM INNEHOLDER HUMANT KILDEMATERIALE
Må behandles som potensielt infektiøst.
Hver serum/plasma-donorenhet som brukes ved preparering av dette produktet har blitt
testet av en metode godkjent av amerikanske FDA og påvist ikke-reaktiv for
tilstedeværelsen av HBsAg, antistoff mot HCV og antistoff mot HIV 1/2. Selv om disse
metodene er svært nøyaktige, garanterer de ikke at alle infiserte enheter vil detekteres.
Dette produktet kan også inneholde annet humant kildemateriale som det ikke
foreligger godkjente tester for. Siden ingen kjent testmetode kan tilby fullstendig
forsikring om at hepatitt B-virus, hepatitt C-virus (HCV), Humant immunsviktvirus (HIV)
eller andre smittestoffer er fraværende, må alle produkter som inneholder humant
kildemateriale håndteres i overensstemmelse med god laboratoriepraksis ved hjelp av
egnede forholdsregler som beskrives i håndboken fra amerikanske Centers for Disease
Control and Prevention/National Institutes of Health, "Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories," 4. utg., mai 1999 eller nåværende utgave.
REAGENSER SOM INNEHOLDER NATRIUMAZID
FORSIKTIG: Noen reagenser i dette kitet inneholder natriumazid. Natriumazid kan
reagere med bly- eller kopperrør og danne svært eksplosive metallazider. Ved
avhending må det skylles ned med mye vann for å forebygge oppbygging av azid. Hvis
du vil ha mer informasjon, kan du se "Decontamination of Laboratory Sink Drains to
Remove Azide Salts," i Manual Guide-Safety Managment no. CDC-22 utgitt av Centers
for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA, USA, 1976.
EU-risikosetninger for farlige stoffer (rådsdirektiv 1999/45/EC)
R20/21/22 – Skadelig ved innånding, hudkontakt og svelging.
R32 – Kontakt med syrer frigjør svært giftig gass.
S28 – Etter kontakt med hud, må du straks vaske med rikelig med vann.
REAGENSER SOM INNEHOLDER ETANOL
EU-risikosetninger for farlige stoffer (rådsdirektiv 1999/45/EC)
R11 – Svært brannfarlig
S16 – Hold på avstand fra tennkilder — Ingen røyking.
S43 – Ved brannslokking, bruk pulver eller karbondioksid
123
REAGENSER SOM INNEHOLDER JOD-125
Dette kitet inneholder radioaktivt materiale som ikke overstiger 5,5 μCi (204 kBq) jod-
125. Passende forholdsregler og god laboratoriepraksis skal brukes i oppbevaringen,
håndteringen og avhendingen av dette materialet.
For praktikere eller institusjoner som mottar radioisotoper under en generell lisens.
Dette radioaktive materialet kan kun mottas, anskaffes, eies og anvendes av leger,
veterinærer som praktiserer veterinærmedisin, kliniske laboratorier eller sykehus, og
kun for in vitro kliniske eller laboratorietester som ikke omfatter innvortes eller utvortes
administrasjon av materialet, eller stråling fra dette, til mennesker eller dyr. Mottak,
anskaffelse, eierskap, bruk og overføring er underlagt forordningene og den generelle
lisensen fra amerikanske Nuclear Regulatory Commission eller staten som
kommisjonen har inngått en avtale med angående utøvelsen av lovgivende myndighet.
1. Oppbevaring av radioaktivt materiale skal begrenses til et spesifikt angitt område.
2. Tilgang til radioaktive materialer må uukkende begrenses til autorisert
personale.
3. Pipetter ikke radioaktivt materiale med munnen.
4. Spis eller drikk ikke innen angitte radioaktive arbeidsområder.
5. Områder der utslipp kan forekomme, skal tørkes og deretter vaskes med et
alkalisk vaskemiddel eller en radiologisk dekontamineringsløsning. Alt brukt
glasstøy må rengjøres grundig med vann før de vaskes med annet glasstøy i
laboratoriet.
For praktikere eller institusjoner som mottar radioisotoper under en generell lisens:
Mottak, bruk, overføring og avhending av radioaktive materialer er underlagt
forordningene og betingelsene i din spesifikke lisens.
ADVARSEL: Dette produktet inneholder et kjemikalie som er kjent som
kreftfremkallende i den amerikanske staten California.
NB: Radioaktivitet som er angitt på pakningsvedlegget kan variere noe fra
radioaktiviteten som er angitt på etiketten på esken og etiketten på flasken med
sporstoff. Etiketten på esken og flasken med sporstoff angir den faktiske mengden
radioaktivitet ved kalibreringsdatoen, mens pakningsvedlegget angir kitets teorietiske
radioaktivitet.
6. INDIKASJONER PÅ MULIG FORRINGELSE AV KIT-REAGENSER
6.1 Forekomsten av abnormt partikulært materiale i noen av reagensene.
6.2 En endring av kalibratorkurvens posisjon eller helling i forhold til det normale
resultatet.
6.3 En reduksjon av maksimal binding.
6.4 En høy uspesifikk binding.
7. PRØVETAKNING OG PREPARERING AV SERUM OG PLASMA
1,25-dihydroksyvitamin D-kitet krever 500 μL serum eller EDTA-plasma for å utføre
analyseekstraksjonen. Et volum på 1,5 mL vil gjøre det mulig å gjenta analysen
samtidig som det gir tilstrekkelig pipetteringsvolum.
Kitet kan brukes både med humant serum og human plasma. Antikoagulansen EDTA
kan brukes med denne analysen. En fasteprøve anbefales men er ikke et krav. Blod
skal tas aseptisk ved hjelp av venepunksjon i et 5 eller 10 mL evakuert glassrør.
For serum, må du la blodet levre seg ved romtemperatur (15-25°C). Sentrifuger i
15 minutter ved ca. 760 x g* for å oppnå sera uten hemolyse. Ingen tilsetningsmidler
eller konserveringsmidler kreves for å opprettholde prøvens integritet. Alle plastartikler,
glassvarer eller andre materialer som kommer i kontakt med prøven må være helt fri
for kontaminerende stoffer.
* g = (1118 x 10-8 ) (radius i cm) (rpm)2
124
Serum- eller plasmaprøver må oppbevares ved -15°C eller lavere. Prøver må ikke
fryses og tines flere ganger. En studie gjennomført av DiaSorin påviste imidlertid ingen
signifikant endring i verdier som følge av at prøvene gjennomgikk 3 sykluser med
frysing-opptining. DiaSorin har oppbevart prøver i opptil 6 måneder ved -15°C eller
lavere uten at dette har ført til en signifikant forandring av resultatene.
8. UTSTYR OG MATERIALE SOM KREVES, MEN IKKE FØLGER MED
8.1 C18OH-kassetter (24 kassetter) bestilt separat med DiaSorins katalognummer
65101E.
8.2 Engangs borosilikatrør av glass, 12 x 75 mm og 13 x 100 mm.
8.3 Prøverørstativ.
8.4 Parafilm eller tilsvarende for å dekke over prøverørene.
8.5 Skumstativ for dekantering eller tilsvarende.
8.6 Sentrifuge med plass til 12 x 75 mm rør og mulighet til å oppnå
1800 x g*.
8.7 Gammaler som kan le 125I.
8.8 Rotasjonsblander.
8.9 Pipetteringsinnretninger:
a. Mikropipetter kalibrerte for 75 μL, 300 μL og 500 μL.
b. Repeterende dispensere for 50 μL, 300 μL og 500 μL.
c. Volumetriske pipetter for rekonstituering av kalibratorer, 3,0 mL.
8.10 Avionisert eller destillert vann.
8.11 Organiske løsningsmidler:
Følgende løsningsmidler behøves for preparering og ekstraksjon av prøvene.
Bruk kun løsningsmidler av HPLC-kvalitet.
La ikke noe av det organiske løsningsmidlet komme i kontakt med
syrevasket glasstøy eller andre sure betingelser.
a. Acetonitril.
b. Metanol.
c. Heksan. (VIKTIG: n-heksan i prosent må være minst 95 %)
d. Metylenklorid (må ikke inneholde alkohol som konserveringsmiddel).
e. Isopropanol (2-propanol).
8.12 Anbefalt apparat C18OH-kassettene:
a. Vac Elut prøvebehandlingsstasjon. Behandler 24 kolonner per analyse.
Kan bestilles fra Analytichem International eller DiaSorin. Hvis du vil
bestille fra DiaSorin, bruker du DiaSorins katalognummer 11610.
8.13 Nødvendig materiale for tørkning av prøver:
a. Nitrogengass.
b. Tørkegrenrør med 37°C (±2°C) varmeblokk eller vannbad:
N-EVAP eller MULTI-VAP som kan bestilles fra Organomation Associates
(Berlin, Massachussets, USA) eller Reacti-Vap II og Reacti-Therm III som kan
bastilles gjennom Pierce Chemical Company (Rockford, Illinois, USA).
* g = (1118 x 10-8 ) (radius i cm) (rpm)2
125
9. PREPARERING AV ORGANISKE LØSNINGSMIDLER FOR
KOLONNEEKSTRAKSJONEN
MERK: De organiske løsningsmiddelblandingene skal prepareres før den
forberedende ekstraksjonsprosedyren påbegynnes.
FORHOLDSREGLER:
Preparer løsningsmiddelblandinger som beskrevet i TABELL I. DiaSorin anbefaler et
preparert volum på 500 mL. Større eller mindre volum kan prepareres så lenge som
proporsjonene forblir de samme. Volumene skal imidlertid være store nok til å
minimere målingsfeil. Mål opp hvert løsningsmiddel separat for beste resultat.
FORHOLDSREGLER:
Bruk destillert eller avionisert vann der det er relevant.
TABELL I
Preparering av løsningsmiddel
Proporsjoner Løsningsmiddel 1 l 500 mL
metanol 700 mL 350 mL
70:30
vann 300 mL 150 mL
heksan 900 mL 450 mL
90:10
metylenklorid 100 mL 50 mL
heksan 990 mL 495 mL
99:1
IPA 10 mL 5 mL
heksan 920 mL 460 mL
92:8
IPA 80 mL 40 mL
10. FORBEREDENDE EKSTRASJONSPROSEDYRE
10.1 Rekonstituer hver lyofiliserte kalibrator med 3,0 mL av kalibrator null. Bland
kalibratorene godt og la dem stå i 15-20 minutter slik at rekonstitueringen blir
fullstendig. Tin eventuelle fryste reagenser fullstendig. La alle reagenser anta
romtemperatur. Se til at reagensene ikke blir varmere enn 25°C. Bland alle
reagenser godt før bruk.
10.2 Pipetter 500 μL av hver kalibrator (0-5), kontroll og pasientprøve til merkede
12 x 75 mm borosilikatrør av glass.
10.3 Tilsett 500 μL acetonitril til hver prøve og roter nå og da, minst 3 ganger,
i løpet av en tidsperiode på 10 minutter.
10.4 Sentrifuger rørene ved 760 x g* i 10 minutter ved 20-25°C.
10.5 Dekanter supernatantene fra prøvene til merkede 12 x 75 mm eller 13 x
100 mm (hvis ønsket) prøverør. Avhend pelletene.
10.6 Tilsett 500 μl forbehandlingsløsning til hvert rør og roter.
MERK: Kitet er beregnet på å rekke til 48 ekstraksjoner inkludert kalibratorene
og kontrollene samt 40 ukjente prøver. Dette betyr at 24 prøver kan
ekstraheres på VacElut-enheten umiddelbarat og de resterende
24 prøvene senere. Kolonneekstraksjonene skal utføres så snart som mulig
etter at forbehandlingsløsningen er tilsatt. Så snart en kolonne er ekstrahert,
kan imidlertid prøver oppbevares i 96 timer ved -15 °C eller lavere.
10.7 Prøvene er nå klare til å appliseres på C18OH-kassettene.
* g = (1118 x 10-8 ) (radius i cm) (rpm)2
126
11. KOLONNEPROSEDYRE
11.1 En beskrivelse av hvordan VAC ELUT fungerer kan finnes i bruksanvisningen
dens. Sett sammen stasjonen i henhold til anvisningene.
11.2 Merk et 13 x 100 mm borosilikatrør av glass for hver kalibrator (0-5), kontroll
og ukjente prøve. Sett rørene i VAC ELUT. Kontroller at lokket på VAC ELUT
er i posisjonen "WASTE" (avfall) og at rørene er plasserte slik at de samler
opp riktig eluat. Plasser C18OH-kassettene på VAC ELUT-lokket.
11.3 Tilsett løsningsmiddelblandingene til den angitte kassetten som beskrevet i
TABELL II.
VIKTIG:
Bruk av vakuum:
Sett på vakuum etter hver tilsetning av løsningsmiddel og la
løsningsmiddelblandingen passere fullstendig gjennom kassetten før du går
videre til neste løsningsmiddel. Slå på og av vakuum ved de anbefalte trinnene i
TABELL II (hvis ønsket, kan vakuum slås av mellom hver tilsetning av
løsningsmiddel). Vakuumet skal være innstilt på 254 mm Hg (10 tommer) eller
lavere. Eluer hver løsningsmiddelblanding gjennom ”WASTE” (avfall)-utløpet til de
egnede avfallsbeholderne fram til det endelige oppsamlingstrinnet.
Applisering av prøve:
Prøvene kan enten dekanteres direkte på kassetten eller appliseres med pipette.
La ikke kassettene lufttørke i mer enn 5 minutter mellom appliseringene.
Forbehandling av C18OH-kassetter:
C18OH-kassettene skal vaskes med 5 mL heksanmetylenklorid (90:10), 5 mL
IPA og 5 mL metanol før de brukes for første gang. Heksanmetylenkloridblandingen
(90:10) kan prepareres ved å måle 900 mL heksan og
100 mL metylenklorid. Plasser de nye, ubrukte kassettene på VAC ELUTapparatet,
still den i ”WASTE” (avfall)-posisjon og tilsett 5 mL heksanmetylklorid
(90:10) etterfulgt av 5 mL IPA til hver kolonne og deretter 5 mL metanol. La hver
løsningsblanding passere helt gjennom kassettene før du går videre til neste
blanding. Etter denne innledende prepareringen, vil det ikke være nødvendig å
gjenta dette trinnet siden kassettene vil regenereres under ekstraksjonen.
MERK: Hvis flere prøver skal ekstraheres (mer enn 24), regenererer du
kassettene ved hjelp av den samme metoden som beskrives i TABELL II.
Kassettene kan gjenbrukes opptil 30 ganger.
MERK: Materialet i C18OH-kassettene holdes på plass av en porøs fiberfritte.
Avhend kassetter med løse eller manglende fritter, siden C18OH-materialet kan gå
tapt.
127
TABELL II
Beskrivelse og analyse av
ekstraksjonen
Ekstraksjonstrinn Håndtering av
elueringsvæske
1. Tilsett 1 mL metanol, slå på
vakuum.
Preparering/regenerasjon av
kolonne Fjerner: Interfererende
substanser fra foregående bruk
(trinn 1) 2. Slå av vakuum.
Avhend
“WASTE”
Applisering av prøve 3. Appliser alle prøver, slå på
vakuum. Fra Forberedende
ekstraksjonsprosedyre (trinn 10).
Avhend
“WASTE”
Rensing/fjerning av Dvitaminmetabolitter
4. Tilsett 5 mL metanolvannblanding
(70:30,
avionisert eller destillert)
Fjerner: Interfererende polare lipider,
salter og pigmenter (trinn 4)
5. Tilsett 5 mL
heksan/metylklorid (90:10).
25(OH)D (trinn 5) 6. Tilsett 5 mL
heksan/isopropanol (99:1).
Gjenværende 25(OH)D og 24,25(OH)2
D/25,26(OH)2 D (trinn 6)
7. Slå av vakuum.
Avhend
“WASTE”
Innsamling av 1,25-(OH)2 D VIKTIG!
Buering av renset 1,25-(OH)2 D
(trinn 9)
8. Sett Vac Elut til ”Collect:”
9. Tilsett 3 mL
heksan/isopropanol (92:8),
slå på vakuum.
10. Slå av vakuum.
“COLLECT”
12. TØRKNING OG REKONSTITUERING AV ELUATER
12.1 Plasser prøverørene med eluatene i en varmeblokk eller et vannbad ved
37°C (±2°C) for tørkning.
12.2 Tørk eluatene under et avtrekksskap ved 2-4 psi nitrogengass (tørketid 20-
30 minutter).
12.3 Ta ut rørene så snart eluatet har tørket.
12.4 Rekonstituer hvert av de tørkede ekstraktene med 50 μL 95 % etanol og roter
forsiktig ved lav til mellomhøy hastighet. Tilsett 125 μL sporstoff til de samme
rørene og roter forsiktig igjen ved lav til mellomstor hastighet. MERK:
Roteringstrinnene er svært viktige for å sikre at prøvene rekonstitueres på
riktig måte og for å få god presisjon. FORSIKTIG: Hold rotasjonsblandingen
mot den nederste delen av røret for å unngå at prøvevolum går tapt. Dette vil
sørge for at det er nok pipetteringsvolum for analysen. Merk opp ett ekstra rør
for totalling og ett rør for NSB. Tilsett 50 μL 95 % etanol og 125 μL
sporemne til begge rørene. Disse vil brukes til å skape de doble rørene for TC
(totalling) og NSB for analyseoppsettet.
12.5 Utfør analysen umiddelbart etter at prøvene er rekonstituerte. Ved større
analyser oppnås best resultat ved å rekonstituere 12-15 prøver om gangen og
deretter pipettere dem til analysen før de neste 12-15 prøvene rekonstitueres.
128
13. ANALYSEPROSEDYRE
13.1 Still opp merkede 12 x 75 mm engangs borosilikatrør av glass i duplikat for
hver kalibrator (0-5), kontroll og prøve i henhold til analyseskjemaet. Tilsett
forsiktig 75 μL rekonstituert ekstrakt av kalibrator, kontroll og prøve til de
duplikate analyserørene.
FORSIKTIG: Dette trinnet må utføres med omhu siden det kun finnes 25 μL
ekstra i hvert rør.
13.2 Se trinn 4, "Tørkning og rekonstituering av eluater". Tilsett 75 μL fra røret for
TC (totalling) til duplikate analyserør. Gjenta dette trinnet for de duplikate
NSB-analyserørene.
13.3 Tilsett 300 μL NSB-buffer til NSB-rørene.
13.4 Tilsett 300 μL primært antistoff til alle rørene med unntak av totallinger og
NSB-rør.
13.5 Bland godt, inkuber i 2 minutter (±15 minutter) ved 20-25°C.
MERK: Rekonstituer GAR-utfellingskomplekset med 35 mL destillert eller
avionisert vann. Bland grundig til suspensjonen virker homogen og la den
deretter stå i minst 30 minutter ved romtemperatur. Bland nå og da før og
under bruk.
13.6 Tilsett 500 μl godt blandet GAR-utfellingskompleks til alle rør med unntak av
totallingsrørene. Inkuber i 20 minutter (±5 minutter) ved 20-25°C.
13.7 Sentrifuger samtlige rør i 20 minutter ved 20-25°C og 1800 x g*, med unntak
av totallingsrørene.
13.8 Dekanter supernatantene, med unntak av totallingsrørene, med en
rørstativholder av skum eller tilsvarende ved å snu stativet opp ned over en
passende avfallsbeholder. Still det vendte stativet på absorberende papir i
2-3 minutter. Trykk papiret forsiktig mot røråpningen for å sørge for at all
væsken fjernes.
13.9 Mål radioaktiviteten ved å le alle rør i 1 minutt i en gammaler. Rørene må
les i minst 1 minutt (se avsnittet Prosedyrebegrensninger).
14. PROSEDYREKOMMENTARER
14.1 Tilsett hver reagensalikvot til den nederste tredjedelen av prøverøret slik at
reagensene blandes fullstendig.
14.2 Korrekte proporsjoner av løsningsmidler er avgjørende for god gjenvinning.
Løsningene må prepareres i store nok volum til å minimere målingsfeil.
14.3 Hvis en prøve gir en høyere verdi enn den høyeste kalibratoren, skal den
analyseres på nytt ved å fortynne den med kit-kalibratoren null før ekstraksjon.
Resultater skal multipliseres med den passende fortynningsfaktoren. For
eksempel kan 500 μL av prøven blandes med 500 μL av kalibrator null, og
deretter analyseres 500 μL av denne prøveblandingen i henhold til
pakningsvedlegget.
14.4 Ingen analyseavvik ble observert i den gjennoittlige tiden det tar å utføre
analyse på 100 rør.
* g = (1118 x 10-8 ) (radius i cm) (rpm)2
129
14.5 For å fullstendig bekrefte at en RIA-analyse gir konsekvente resultater, kan
laboratoriet kontrollere en rekke andre faktorer. DiaSorin anbefaler
regelmessig kontroll av følgende parametre for å forsikre konsekvent kitfunksjon.
a. Totallinger
b. Maksimal binding
Gjennoittlige linger per minutt (CPM) for rør med 0-kalibrator/CPMgjennoitt
for totallingsrør.
c. Uspesifikk binding
CPM-gjennoitt for NSB-rør/CPM-gjennoitt for totallingsrør.
d. Kalibratorkurvens helling
50 % suppresjon kan måles.
15. KVALITETSKONTROLL
Hvert laboratorium bør ta med minst to kontroller (en for normalt nivå og en for forhøyet
nivå) i hver analyse for å kontrollere kitets egenskaper. Kommersielt tilgjengelige
kontroller eller de to referansekontrollene som følger med kitet kan benyttes.
De brukte kontrollene skal behandles som ukjente prøver og analyseres i duplikat.
Diagrammer for kvalitetskontroll bør føres av laboratoriet for å følge med på
kontrollenes funksjon. Akseptable utførelsesgrenser skal bestemmes av hvert enkelt
laboratorium for hvert kontrollnivå ved hjelp av statistiske metoder beregnet på å
detektere både tilfeldige og systematiske feil. Kontrollresultater må overholde
laboratoriets kriterier for godkjennelse før resultatene fra pasientprøvene
rapporteres.12,13,14
16. BEREGNING AV RESULTATER
Det finnes mange metoder for å beregne resultatene fra RIA-analyser. Alle tar
utgangspunkt i å få fram en kalibreringskurve ved å plotte bindingsgraden mot de
angitte konsentrasjonene for kalibreringsløsningene. Dette diagrammet kan ha enten
lineær eller logaritmisk skala. Hver av disse metodene gir stort sett de samme verdiene
for kontroller og prøver, selv om visse analyser kan "passe" bedre til en bestemt
metode enn en annen. Beregningsmetoden som benyttes ved DiaSorins laboratorier
for kvalitetskontroll er en beregningsmetode basert på %B/B0 kontra logaritmisk
konsentrasjon ved hjelp av et program for myk tilpasning til Spline-funksjoner.
16.1 Beregning av B/B0 i prosent
a. Beregn CPM-gjennoitt for hver kalibrator, kontroll og ukjente prøve.
b. Subtraher CPM-gjennoittet for NSB-rørene fra alle verdiene.
c. Del den korrigerte CPM-verdien for hver kalibrator, kontroll eller ukjente
prøve med den korrigerte CPM-verdien for 0-kalibratoren og multipliser
med 100.
gj.sn. CPM (kalibrator eller ukjent prøve) – gj.sn. CPM (NSB)
gj.sn. CPM (0-kalibrator) – gj.sn. CPM (NSB)
x 100 = B/B0 (%)
16.2 Bruk av kalibratorkurvediagram
a. Bruk et dobbeltlogaritmisk kurvepapir eller semilogaritmisk kurvepapir på
2 sykluser og plott B/B0 (%) i prosent for 1,25 (OH)2D-kalibratorer på den
vertikale aksen (Y-aksen) mot kalibratorkonsentrasjonen på den
horisontale aksen (X-aksen).
130
MERK: Automatiske datareduksjonsprogrammer kan også brukes til å
analysere data. DiaSorin benytter Multi-Calc (Pharmacia) med en myk
LIN-LOG-tilpasning til SPLINE-funksjoner. Andre datareduksjonsmetoder
må valideres før de tas i bruk regelmessig.
b. Tegn den best tilpassede linjen mellom punktene.
c. Interpoler 1,25-(OH)2D-nivåene i prøvene fra kalibratordiagrammet.
d. Hvis en ukjent prøve har blitt fortynnet, må du korrigere for den egnede
fortynningsfaktoren.
e. Det rapporterbare området for analysen er 5,0 pg/mL til 200 pg/mL.
Eventuelle verdier som ligger under den laveste kalibratoren, 5,0 pg/mL,
er ekstrapolerte og kan rapporteres som “mindre enn 5 pg/mL”.
f. Beregn maksimal binding ved å dele CPM for 0-kalibratoren med de
gjennoittlige totallingene fra totallingsrørene.
Typiske prøvedata for 1,25-(OH)2D-RIA vises i TABELL IV og FIGUR 1. Denne
informasjonen er kun for referanse og skal ikke brukes til å beregne noen verdier.
TABELL IV
Eksempeldata for DiaSorin 1,25-(OH)2D-RIA
Rør
Duplikat
CPM
Gj.sn.
CPM
Korrigert
CPM
Prosent
bundet
(B/T)
Prosent
(B/B0)
Kons.
(pg/mL)
Totalling 40.792 40.685
40.578
NSB 1.438 1.439 3,5
1.439
0-kalibrator 18.006 18.063 16.624 44,4 100,0
18.119
Kalibratorer
(pg/mL)
1 (5,0) 16.710 16.740 15.302 92,0
16.770
2 (15,0) 14.941 14.929 13.490 81,2
14.916
3 (30,0) 13.087 13.106 11.667 70,2
13.124
4 (75,0) 9.820 9.793 8.354 50,2
9.765
5 (200) 6.412 6.438 5.000 30,0
6.464
Kontroller
Nivå 1: 13.275 13.403 11.964 72,0 27,3
normalt nivå 13.530
Nivå 2: 8.206 8.165 6.727 40,5 119
høyt område: 8.124
131
Eksempel på kalibratorkurve for DiaSorin 1,25-(OH)2D-RIA
FIGUR 1:
DATAREDUKSJON
DiaSorins laboratorium for kvalitetskontroll bruker en myk tilpasning til SPLINEfunksjoner.
17. PROSEDYRENS BEGRENSNINGER
17.1 lingstidene må være lange nok til å unngå statistiske feil grunnet ineffektiv
ling (for eksempel gir en mengde på 2000 CPM en feil på 5 %, mens
10 000 CPM gir en feil på 1 %).
17.2 Analyseresultater skal brukes i sammenheng med øvrige kliniske data og
laboratoriedata for å hjelpe klinikeren med å ta beslutninger om individuell
pasientstyring.
17.3 Utførelsesegenskapene for denne analysen har ikke blitt etablert i en
pediatrisk populasjon.
18. FORVENTEDE VERDIER
Referanseintervall for friske blodgivere
Det er viktig at hvert laboratorium etablerer sitt eget referanseintervall som er
representativt for dets typiske pasientpopulasjon. Det har imidlertid blitt samlet inn
1,25-(OH)2D-verdier fra 123 tilsynelatende friske frivillige fra tre midtvestlige
amerikanske byer i en klinisk studie utført ved tre steder i løpet av sommer- og
høstmånedene. Disse 123 friske blodgiverne besto av en rasemessig blandet gruppe
på 37 menn og 86 kvinner mellom 21 og 68 år. Den gjennoittlige 1,25-(OH)2Dverdien
for hele prøven (n=123) var 43,9 pg/mL. Referanseintervallet på 95 % beregnet
ved hjelp av en ikke-parametrisk metode (i henhold til NCCLS' retningslinje C28-A215)
var 25,1-66,1 pg/mL.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 10 100 1000
pg/mL
% B/Bo
132
Pasienter med terminal nyresykdom
En klinisk studie ble gjennomført for å evaluere 1,25-(OH)2D-nivåene i en voksen
populasjon med diagnosen terminal nyresykdom. Prøver fra 87 slike frivillige (49 menn
og 38 kvinner mellom 19 og 84 år) fra tre midtvestlige amerikanske byer ble samlet inn
og analysert. Det observerte området 1,25-(OH)2D-verdier for denne prøven (n=87) var
1,6-17,3 pg/mL. Den øvre referansegrensen på 95 % beregnet av den ikkeparametriske
prosedyren er 14,2 pg/mL.
19. SPESIFIKKE UTFØRELSESEGENSKAPER
19.1 Presisjon
DiaSorin vurderte presisjonen for analysen basert på prinsippene i CLSI’ retningslinje
(EP5-A).16 Tre kontrollnivåer basert på humant serum med 1,25-(OH)2-Dkonsentrasjoner
fordelt over hele analyseområdet ble analysert i løpet av 25
analysedager, i en periode på over 60 driftsdager. Flere teknikere samt flere ulike
partinumre for alle komponentene inngikk. De kombinerte resultatene ble evaluert ved
hjelp av variansanalyse (ANOVA) og oppsummeres i følgende tabell.
Innen-serie Mellom dager Total
Prøve N
Gj.sn.
pg/mL S.D. %CV S.D. %CV S.D. %CV
LAV 25 25,8 1,76 6,8 3,8 14,6 4,0 15,3
MIDDELS 25 41,3 3,16 7,7 4,6 11,1 5,1 12,3
HØY 25 105,2 11,86 11,3 11,8 11,2 14,4 13,7
19.2 Sikkerhet: Analysens sikkerhet har blitt kontrollert ved hjelp av en
linearitetstest og en gjenvinningstest.
Linearitet (parallellitet)
Lineariteten ved fortynning ble evaluert av DiaSorin i henhold til anbefalningene i CLSI’
retningslinje EP6-P.17 Tre pooler av pasientsera ble preparert gjennom seriell
fortynning med kalibrator null og oppdelt i porsjoner fryste ved –20°C. Hver prøve og
fortynning ble analysert gjentatte ganger på tre ulike datoer. De forventede verdiene
ble bestemt ved de ufortynnede verdiene for hver prøvepool multiplisert med
fortynningsfaktoren. Data oppsummeres nedenfor og de sammenlagte resultatene
plottes som en lineær regresjon av forventet kontra observert verdi.
Prøvenr. Fortynning
Forventet verdi
(pg/mL) (N=10)
Gj.sn. observert
verdi (pg/mL)
(N=10)
UFORTYNNET 49,6 49,6
1:2 24,8 25,3
1 1:4 12,4 11,1
1:8 6,2 4,4
UFORTYNNET 50,2 50,2
1:2 25,1 24,2
2 1:4 12,6 12,2
1:8 6,3 4,6
UFORTYNNET 62,0 62,0
1:2 31 31,9
3 1:4 15,5 13,4
1:8 7,8 6,2
133
Gjenvinning
Analysens evne til å kvantitativt gjenvinne all analytten i de kliniske prøvene ble
evaluert ved å tilsette ulike mengder nypreparert rent 1,25-(OH)2-D-antigen til tre
pasientprøvepooler. Tre konsentrasjoner ble valgt og analysert i duplikat, og
gjenvinningen ble bestemt i prosent. Gjennoittlig %-gjenvinning med denne
metoden var 101 %.
Prøvenr.
Oppr. kons.
(pg/mL) 1,0 mL
Tilsatt
mengde (pg)
*Forventet
(pg/mL)
Observert
(pg/mL)
%
gjenvinning
50,0 77,7 75,6 97
1 30,8 62,5 88,9 87,2 98
75,0 99,8 103 103
50,0 89,2 89,5 100
2 42,8 62,5 100,3 98,9 99
75,0 111,0 118 106
50,0 86,8 83,9 97
3 40,3 62,5 97,9 103 105
75,0 108,8 118 108
*Forventet beregning av konsentrasjon inkluderer fortynningsfaktoren som ble
introdusert med den tilsatte løsningen.
19.3 Analytisk sensitivitet
Analysens sensitivitet, når den defineres som den laveste mengden som kan skilles
fra null ved 2 standardavvik under CPM-gjennoittet for 0-kalibratoren (n = 20), har
vist seg å være < 2,0 ng/mL.
19.4 Analytisk spesifisitet
Data vedrørende kryssreaktivitet av antiserum som brukes i dette kitet uttrykkes
som forholdet mellom 1,25-(OH)2D3-konsentrasjon og den kryssreagerende
substanskonsentrasjonen ved 50 % hemming av maksimal binding.
Analytt Kons. ved 50 % B/Bo % kryssreaktivitet
24,25 D3 76.420 pg/ml <0,5
25,26 D3 24.330 pg/ml <0,5
25 D3 >>>1 mg/ml <0,5
19.5 Interfererende stoffer
En interferensstudie ble gjennomført for å determinere hvorvidt forhøyede nivåer av
vanlige endogene stoffer kan ha en negativ innvirkning på analyseresultatene.
Evalueringen var konsekvent med CLSI’ retningslinjer (EP7-P).18 Tre prøver basert på
humant serum med lave, medium eller høye nivåer1,25-(OH)2-D3 ble enten testet med
tilsetninger av prøvestoffet eller som kontroller tilsatt identiske mengder av
prøvestoffets buffer. Hver prøve ble ekstrahert to ganger, hvilket ga firedoble analyser.
Resultene presentert nedenfor viser at det ikke fantes noen interferens fra noen av de
testede stoffene, hvilket ble determinert av statistisk analyse med ANOVA (95 %
konfidensintervall), eller ved at gjennoittsverdien til de tilsatte prøvene avvek fra
kontrollene med mer enn ± 2 standardavvik for kalibratorene.
134
Bilirubin
Prøvenr.
Gj.sn. for
kontroll
(pg/mL)
2 SD-område
for kontroll
Gj.sn. for
bilirubin
(pg/mL)
Interferens
ANOVA
Lav 19,9 18,5-21,3 19,5 0,54
Middels 31,7 27,7-35,7 29,9 0,22
Høy 79,7 63,5-95,9 83,2 0,45
Kolesterol
Prøvenr.
Gj.sn. for
kontroll
(pg/mL)
2 SD-område
for kontroll
Gj.sn. for
kolesterol
(pg/mL)
Interferens
ANOVA
Lav 19,9 18,5-21,3 19,4 0,64
Middels 31,7 27,7-35,7 29,7 0,15
Høy 79,7 63,5-95,9 75,2 0,40
Triglyserid
Prøvenr.
Gj.sn. for
kontroll
(pg/mL)
2 SD-område
for kontroll
Gj.sn. for
triglyserid
(pg/mL)
Interferens
ANOVA
Lav 14,7 12,9-16,5 15,1 0,88
Middels 30,4 22,4-38,4 33,4 0,25
Høy 92,6 69,5-116,9 95,4 0,68
Hemoglobin
Prøvenr.
Gj.sn. for
kontroll
(pg/mL)
2 SD-område
for kontroll
Gj.sn. for
hemoglobin
(pg/mL)
Interferens
ANOVA
Lav 21,5 17,5-25,5 20,8 0,53
Middels 38,6 35,4-41,8 40,0 0,43
Høy 112,7 101,4-124,0 120,6 0,17
Urea
Prøvenr.
Gj.sn. for
kontroll
(pg/mL)
2 SD-område
for kontroll
Gj.sn. for
urea
(pg/mL)
Interferens
ANOVA
Lav 25,1 20,9-29,3 26,6 0,39
Middels 36,2 23,8-48,6 35,9 0,96
Høy 120,1 97,4-142,8 118,6 0,82
SE DEN SISTE SIDEN FOR REFERANSER
135
ANALYSESKJEMA
1. Kalibratorer, kontroller og ukjente prøver rekonstitueres alle med 95 % etanol
og sporstoff etter tørketrinnet i kolonneprosedyren.
2. Pipetter reagens i henhold til følgende skjema:
Rør/reagenser
Totalli
nger NSB
Kal.
0-5
Kontroller og
ukjente prøver
Rekonstituerte kalibratorer - - 75 μL -
Rekonstituerte kontroller og
ukjente prøver - - - 75 μL
95 % etanol og sporstoff** 75 μL 75 μL - -
NSB-buffer - 300 μL - -
1,25-(OH)2-D-antiserum - - 300 μL 300 μL
MERK: Rørene for totalling og NSB dannes ved å tilsette 50 μL 95 % etanol med
125 μL sporstoff og pipettere 75 μL av denne blandingen til duplikate analyserør.
3. Bland godt og inkuber i 2 minutter (+/-15 minutter) ved 20-25°C.
4. Pipetter 500 μL GAR-utfellingsreagens til alle brønner, med unntak av
totalreagensrørene.
5. Bland godt og inkuber i 20 minutter (+/-5 minutter) ved 20-25°C.
6. Sentrifuger med 1800 x g* i 20 minutter ved 20-25°C.
7. Dekanter supernatantene.
8. l hvert rør i en gammaler i minst 1 minutt.
*g = (1118 x 10-8) (radius i cm) (rpm)2
136
ΚΙΤ 1,25-DIHYDROXYVITAMIN D 125I RIA
1. ΧΡΗΣΗ ΓΙΑ ΤΗΝ ΟΠΟΙΑ ΠΡΟΟΡΙΖΕΤΑΙ
ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ.
Το κιτ 1,25-Dihydroxyvitamin D 125I RIA είναι μια μέθοδος ραδιοανοσοπροσδιορισμού
ανταγωνιστικής ισορροπίας που προορίζεται για τον ποσοτικό προσδιορισμό της
1,25- διϋδροξυβιταμίνης D (1,25-(OH)2-D) σε ανθρώπινο ορό ή πλάσμα EDTA με
σκοπό την αξιολόγηση της ανεπάρκειας 1,25-(OH)2-D που σχετίζεται με νεφρική νόσο.
Τα αποτελέσματα του προσδιορισμού θα πρέπει να χρησιμοποιούνται από κοινού με
άλλα κλινικά και εργαστηριακά δεδομένα για να βοηθήσουν τον κλινικό ιατρό στη λήψη
αποφάσεων κατά τη διαχείριση μεμονωμένων ασθενών σε έναν πληθυσμό ενηλίκων.
2. ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΚΑΙ ΕΠΕΞΗΓΗΣΗ
Η βιταμίνη D προέρχεται από 2 πηγές: εξωγενείς (διατροφικές) και ενδογενείς (βιοσύνθεση,
που ρυθμίζεται από την έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία). Οι εξωγενείς ή διατροφικές
πηγές περιλαμβάνουν τροφές που περιέχουν φυσικά χαμηλά επίπεδα βιταμίνης D2
(π.χ. γάλα, βούτυρο, δημητριακά με συμπλήρωση βιταμίνης D2), διατροφικά
συμπληρώματα που διατίθενται χωρίς ιατρική συνταγή, και θεραπευτικά παρασκευάσματα
βιταμινών D2.1 Η βιταμίνη D δεν είναι εγγενώς ενεργή όταν εισέρχεται στην κυκλοφορία του
αίματος, μέσω είτε της διατροφικής είτε της φωτοχημικής οδού. Η βιολογική δραστηριότητα
επιτυγχάνεται μετά από μια περίπλοκη σειρά βημάτων του μεταβολισμού.2
Είναι πλέον γνωστό ότι η ενεργοποίηση της βιταμίνης D μέσω του μεταβολισμού
αποτελεί μια περίτεχνα ελεγχόμενη διαδικασία, που υπόκειται σε εκτενείς μεταβολές
από μεταβλητές που συμπεριλαμβάνουν το ασβέστιο και το φώσφορο των τροφών, το
βαθμό της ανεπάρκειας της βιταμίνης D, τις γενετικές ανεπάρκειες, τις συγκεντρώσεις
της παραθυρεοειδούς ορμόνης, την έκθεση στην υπεριώδη ακτινοβολία και την έκταση
της νεφρικής λειτουργίας.3 Η βιοσύνθεση των διυδροξυλιωμένων μορφών της βιταμίνης
D3 ξεκινά με τη δράση του ηλιακού υπεριώδους φωτός επί της 7-αφυδροχοληστερόλης
για το σχηματισμό της βιταμίνης D3 στο δέρμα. Μόλις η βιταμίνη D3 εισέλθει στην
κυκλοφορία, απορροφάται γρήγορα από το ήπαρ όπου μεταβολίζεται σε
25-υδροξυβιταμίνη D3 (25-OH-D3). Το ήπαρ υδροξυλιώνει επίσης τη βιταμίνη D2 των
τροφών σε 25-υδροξυβιταμίνη D2 (25-OH-D2).2,4
Μετά από τη ηπατική υδροξυλίωση, η 25-OH-D μεταφέρεται σε συνδυασμό με τη
δεσμευτική πρωτεΐνη της βιταμίνης D στους νεφρούς όπου λαμβάνει χώρα περαιτέρω
υδροξυλίωση. Η προσθήκη ενός υδροξυλίου στη θέση 1 δίνει 1,25-διυδροξυβιταμίνη D
(1,25-(OH)2-D). Η 1,25-διυδροξυβιταμίνη D είναι ο ισχυρότερος φυσικά προκύπτων
μεταβολίτης της βιταμίνης D που έχει ανακαλυφθεί έως τώρα, και η παραγωγή της
ρυθμίζεται αυστηρά μέσω των συγκεντρώσεων ασβεστίου, φώσφορου και
παραθυρεοειδούς ορμόνης στον ορό. Σε περιόδους έλλειψης ασβεστίου, η 1,25-(OH)2-D
είναι ο σημαντικότερος μεταβολίτης της βιταμίνης D που παράγεται από τους νεφρούς.5,6
Μετά από τη ηπατική υδροξυλίωση, η 25-OH-D μεταφέρεται σε συνδυασμό με τη
δεσμευτική πρωτεΐνη της βιταμίνης D στους νεφρούς όπου λαμβάνει χώρα περαιτέρω
υδροξυλίωση. Η προσθήκη ενός υδροξυλίου στη θέση 1 δίνει 1,25-διυδροξυβιταμίνη D
(1,25-(OH)2-D). Η 1,25-διυδροξυβιταμίνη D είναι ο ισχυρότερος φυσικά προκύπτων
μεταβολίτης της βιταμίνης D που έχει ανακαλυφθεί έως τώρα, και η παραγωγή της
ρυθμίζεται αυστηρά μέσω των συγκεντρώσεων ασβεστίου, φώσφορου και
παραθυρεοειδούς ορμόνης στον ορό. Σε περιόδους έλλειψης ασβεστίου, η 1,25-(OH)2-D
είναι ο σημαντικότερος μεταβολίτης της βιταμίνης D που παράγεται από τους νεφρούς.5,6
Αυτό οφείλεται στον ουσιαστικό ρόλο που παίζει στην αποδοτική, ενεργό απορρόφηση
του ασβεστίου και του φώσφορου, όπως και στο φυσιολογικό μεταβολισμό τους.
Επομένως, η μέτρηση της 1,25-(OH)2-D καθίσταται ταχέως ένα αποτελεσματικό
εργαλείο διερεύνησης των νόσων και παθήσεων που επηρεάζουν το φυσιολογικό
μεταβολισμό του φωσφόρου και του ασβεστίου.7,8,9
137
3. ΑΡΧΗ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ
Ο προσδιορισμός 1,25-(OH)2-D της DiaSorin αποτελείται από μια διαδικασία δύο βημάτων.
Ο προσδιορισμός εμπεριέχει μια προκαταρκτική εκχύλιση και παρεπόμενη κάθαρση των
μεταβολιτών της βιταμίνης D από τον ορό ή το πλάσμα EDTA με χρήση των φυσίγγων
C18OH.10 Μετά την εκχύλιση, το επεξεργασμένο δείγμα προσδιορίζεται χρησιμοποιώντας
μια διαδικασία ανταγωνιστικού ραδιοανοσοπροσδιορισμού (RIA). Η μέθοδος RIA βασίζεται
σε ένα πολυκλωνικό αντίσωμα που είναι ειδικό και για την 1,25-(OH)2 D2 και για την
1,25-(OH)2D3. Το δείγμα, το αντίσωμα και ο ιχνηθέτης υπόκεινται σε επώαση για 2 ώρες
στους 20 έως 25°C. Ο διαχωρισμός φάσεων επιτυγχάνεται μετά από επώαση 20 λεπτών
στους 20 έως 25°C με ένα δεύτερο σύμπλοκο καθίζησης αντισώματος. Μετά από τη
φυγοκέντρηση και τη μετάγγιση, το δεσμευμένο κλάσμα που παραμένει στο σβώλο
μετριέται σε μετρητή γάμμα. Οι τιμές υπολογίζονται απευθείας από μια καμπύλη
βαθμονομητή γνωστών συγκεντρώσεων. Η τελική συγκέντρωση της 1,25-(OH)2D στα
δείγματα ορού και πλάσματος EDTA εκφράζεται σε pg/mL.
4. ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΠΟΥ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ ΜΕ ΤΟ ΚΙΤ
1,25-(OH)2D ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ NSB 1 φιαλίδιο / 3 mL
1,25-(OH)2D ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΤΗΣ Ο 1 φιαλίδιο / 20 mL
1,25-(OH)2D3 ΒΑΘΜΟΝΟΜΗΤΗΣ 1-5 5 φιαλίδια / 3 mL
1,25-(OH)2D ΑΝΤΙΟΡΟΣ 1 φιάλη / 35 mL
125 I 1,25-(OH)2D3 1 φιαλίδιο / 10 mL
1,25-(OH)2D3 ΔΙΑΛΥΜΑ ΠΡΟΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΣ 1 φιάλη / 50 mL
1,25-(OH)2D GAR ΣΥΜΠΛΟΚΟ ΚΑΘΙΖΗΣΗΣ 2 φιαλίδια / 35 mL
1,25-(OH)2D ΟΡΟΣ ΥΛΙΚΟΥ ΕΛΕΓΧΟΥ 2 φιαλίδια / 3 mL
95% ΑΙΘΑΝΟΛΗ 1 φιαλίδιο / 7 mL
Αριθμός Εξετάσεων 100
ΦΥΛΑΞΗ: Με την παραλαβή, το κιτ πρέπει να φυλάγεται στους 2 έως 8°C. Μετά το
άνοιγμα, φυλάξτε κάθε αντιδραστήριο στους 2 έως 8°C έως την ημερομηνία λήξης που
αναγράφεται στην ετικέτα. Τα αντιδραστήρια δεν θα πρέπει να χρησιμοποιηθούν σε
περίπτωση που παρέλθει η ημερομηνία λήξης στην ετικέτα. Η ημερομηνία λήξης του
κιτ αναγράφεται στην εξωτερική ετικέτα και αντιστοιχεί στην ημερομηνία λήξης του
ιχνηθέτη.
Κατά την ανασύσταση του περιεχομένου των φιαλιδίων, αναμίξτε απαλά για να
αποφευχθεί ο σχηματισμός αφρού. Φυλάξτε όλα τα ανασυσταθέντα αντιδραστήρια
στους -15°C ή χαμηλότερα αμέσως μετά τη χρήση τους. Δεν ενδείκνυται η ανάμιξη
αντιδραστηρίων από διαφορετικές παρτίδες.
4.1 1,25-(OH)2D Ρυθμιστικό διάλυμα NSB: Αντιδραστήριο έτοιμο για χρήση
Ρυθμιστικό διάλυμα ζελατίνης φωσφορικού καλίου που περιέχει ProClin 300
(< 0,2%).
4.2 1,25-(OH)2D Βαθμονομητής 0: Αντιδραστήριο έτοιμο για χρήση
Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών που περιέχει πρωτεΐνες βόειου ορού και ProClin 300
(< 0,2%).
4.3 1,25-(OH)2D3 Βαθμονομητές (1-5): Λυοφιλοποιημένο αντιδραστήριο
Πέντε λυοφιλοποιημένοι (1,25-(OH)2D3) βαθμονομητές σε συγκεντρώσεις που
κυμαίνονται από 5 - 200 pg/mL και περιέχουν ανθρώπινο ορό και ProClin 300 (<0,2%).
Ανασυστήστε κάθε βαθμονομητή με 3,0 mL μηδενικού βαθμονομητή. Οι ακριβείς
συγκεντρώσεις αναφέρονται στις ετικέτες των φιαλιδίων. Οι βαθμονομητές των κιτ
βαθμονομούνται με χρήση ποσοτικού προσδιορισμού υπεριωδών. Ο χειρισμός των
βαθμονομητών μπορεί να είναι ίδιος με αυτόν των δειγμάτων ασθενών όταν
χρησιμοποιούνται τα αντιδραστήρια και η λειτουργική διαδικασία της παρούσας
διαγνωστικής δοκιμής in vitro, όπως συνιστάται.
138
4.4 1,25-(OH)2D Αντιορός: Αντιδραστήριο έτοιμο για χρήση
Αντι-1,25-(OH)2D ορού κουνελιού αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών-
ζελατίνης που περιέχει ProClin 300 (<0,2%).
4.5 125I 1,25-(OH)2D3 Αντιδραστήριο έτοιμο για χρήση
Ραδιοϊωδιωμένο ανάλογο 1,25-(OH)2D3 αραιωμένο σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικής
αιθυλενογλυκόλης.
4.6 1,25-(OH)2D3 Διάλυμα προεπεξεργασίας: Αντιδραστήριο έτοιμο για χρήση
Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικού καλίου.
4.7 1,25-(OH)2D Υλικά ελέγχου: Επίπεδο 1 (Φυσιολογικό), Επίπεδο 2 (Αυξημένο):
Αντιδραστήριο έτοιμο για χρήση Μίγμα επεξεργασμένου ανθρώπινου ορού, που
περιέχει ProClin 300 (<0,2%), εμπλουτισμένο με τις κατάλληλες ποσότητες
1,25-(OH)2D για τη λήψη συγκεντρώσεων υλικών ελέγχου εντός προσδιορισμένων
περιοχών τιμών. Το Υλικό ελέγχου 1 βρίσκεται εντός του φυσιολογικού εύρους και το
Υλικό ελέγχου 2 βρίσκεται εντός αυξημένων περιοχών τιμών. Το εύρος των
συγκεντρώσεων κάθε ελέγχου αναφέρεται στο πιστοποιητικό ανάλυσης και δείχνει τα
όρια που έχουν καθοριστεί από την DiaSorin για τιμές ελέγχων που μπορούν να
επιτευχθούν σε αξιόπιστους κύκλους εξετάσεων.
4.8 Σύμπλοκο καθίζησης αίγας αντι-κουνελιού (GAR): Λυοφιλοποιημένο αντιδραστήριο
Φυσιολογικός ορός κουνελιού, που έχει υποστεί εκ των προτέρων καθίζηση με ορό αίγας
αντι-κουνελιού και πολυαιθυλενογλυκόλη (PEG), αραιώνεται σε ρυθμιστικό διάλυμα BSA-
βορικών με προσθήκη νατραζίδιου 0,1% και άλλων συντηρητικών (λυοφιλιωμένα).
Ανασυστήστε το φιαλίδιο με 35 mL απεσταγμένου ή απιονισμένου νερού. Αναμίξτε καλά
έως ότου το εναιώρημα εμφανιστεί ομοιογενές και έπειτα αφήστε το ακίνητο για
τουλάχιστον 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου ανακινώντας το περιστασιακά.
4.9 95% Αιθανόλη: Αντιδραστήριο έτοιμο για χρήση
95% αιθανόλη και 5% νερό.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ:Απαιτούνται επίσης φύσιγγες C18OH για τη διαδικασία αυτή. Οι
φύσιγγες αυτές πρέπει να παραγγελθούν ξεχωριστά με Αρ. κατ. DiaSorin 65101E.
5. ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙΣ ΚΑΙ ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ
ΓΙΑ IN VITRO ΔΙΑΓΝΩΣΤΙΚΗ ΧΡΗΣΗ.
Δεν προορίζεται για εσωτερική και εξωτερική χρήση σε ανθρώπους ή ζώα.
ΠΡΟΣΟΧΗ: Η παρούσα συσκευή θα πρέπει να παραλαμβάνεται, να αποκτάται, να
κατέχεται και να χρησιμοποιείται μόνο από ιατρούς, κλινικά εργαστήρια, νοσοκομεία, ή
ερευνητικές εγκαταστάσεις. Η δοκιμή πρέπει να εκτελείται μόνο από κατάλληλο
διπλωματούχο και ειδικευμένο εργαστηριακό προσωπικό.
ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΥΛΙΚΟ ΑΝΘΡΩΠΙΝΗΣ ΠΡΟΕΛΕΥΣΗΣ
Χειριστείτε ως εάν ήταν δυνητικώς μολυσματικά.
Κάθε δότης ορού/πλάσματος που χρησιμοποιήθηκε στην παρασκευή αυτού του
προϊόντος έχει εξεταστεί με μέθοδο εγκεκριμένη από την Υπηρεσία Τροφίμων και
Φαρμάκων (FDA) των Η.Π.Α. και βρέθηκε μη αντιδραστική ως προς την παρουσία
HBsAg, αντισώματος στον ιό HCV και αντισώματος στον ιό HIV 1/2. Παρότι οι μέθοδοι
αυτές είναι εξαιρετικά ακριβείς, δεν εγγυώνται την ανίχνευση όλων των μολυσματικών
μονάδων. Το παρόν προϊόν ενδεχομένως να περιέχει και άλλο υλικό ανθρώπινης
προέλευσης για το οποίο δεν υπάρχει εγκεκριμένη εξέταση.
139
Επειδή καμία γνωστή μέθοδος δοκιμής δεν μπορεί να προσφέρει πλήρη διαβεβαίωση
ότι απουσιάζουν ο ιός της ηπατίτιδας Β (HBV), ο ιός της ηπατίτιδας C (HCV), ο ιός της
ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας (HIV) ή άλλοι μολυσματικοί παράγοντες, ο χειρισμός
όλων των προϊόντων που περιέχουν υλικά ανθρώπινης προέλευσης θα πρέπει να
γίνεται σύμφωνα με καλές εργαστηριακές πρακτικές χρησιμοποιώντας τις κατάλληλες
προφυλάξεις, όπως περιγράφονται στο. εγχειρίδιο “Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories”, 4η έκδοση, Μάιος 1999 ή την τρέχουσα έκδοση, των U.S.
Centers for Disease Control and Prevention/National Institutes of Health (Κέντρα για
τον Έλεγχο και Πρόληψη Νόσων/Εθνικά Ιδρύματα Υγείας των Η.Π.Α.).
ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΑΖΙΔΙΟ ΤΟΥ ΝΑΤΡΙΟΥ
ΠΡΟΣΟΧΗ: Μερικά αντιδραστήρια στο κιτ αυτό περιέχουν αζίδιο του νατρίου. Το αζίδιο του
νατρίου μπορεί να αντιδράσει με τις σωληνώσεις μολύβδου ή χαλκού και να σχηματίσει
εξαιρετικά εκρηκτικά αζίδια μετάλλων. Κατά την απόρριψη, εκπλύνετε με άφθονη ποσότητα
νερού για να εμποδίσετε τη συσσώρευση αζιδίων. Για περισσότερες πληροφορίες,
ανατρέξτε στην ενότητα “Decontamination of Laboratory Sink Drains to Remove Azide
Salts” (Απορρύπανση των Εργαστηριακών Εγκαταστάσεων για Απομάκρυνση Αλάτων
Αζιδίων), στο Εγχειρίδιο Οδηγό-Διαχείριση Ασφάλειας (Manual Guide-Safety Management)
Αρ. CDC-22 που εκδίδεται από τα Κέντρα για τον Έλεγχο των Ασθενειών και την Πρόληψη
(Centers for Disease Control and Prevention), Ατλάντα, GA, Η.Π.Α. 1976.
Φράσεις κινδύνου για επικίνδυνες ουσίες των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων (Οδηγία
Επιτροπής 1999/45/ΕΕ)
R20/21/22 - Βλαβερό κατά την εισπνοή, σε επαφή με το δέρμα και σε περίπτωση κατάποσης.
R32 - Σε επαφή με οξέα ελευθερώνονται πολύ τοξικά αέρια.
S28 - Σε περίπτωση επαφής με το δέρμα, πλύνετε αμέσως με άφθονο νερό.
ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΑΙΘΑΝΟΛΗ
Φράσεις κινδύνου για επικίνδυνες ουσίες των Ευρωπαϊκών Κοινοτήτων (Οδηγία
Επιτροπής 1999/45/ΕΕ)
R11 - Λίαν εύφλεκτο
S16 - Μακριά από πηγές ανάφλεξης - Απαγορεύεται το κάπνισμα
S43 - Σε περίπτωση πυρκαγιάς, χρησιμοποιήστε πυροσβεστήρες ξηρών χημικών
ουσιών ή διοξείδιο του άνθρακα
ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΑ ΠΟΥ ΠΕΡΙΕΧΟΥΝ ΙΩΔΙΟ-125
Το κιτ αυτό περιέχει ραδιενεργό υλικό το οποίο δεν υπερβαίνει τα 5,5 μCi (204 kBq)
ιώδιο-125. Κατά τη φύλαξη, το χειρισμό και τη διάθεση του υλικού αυτού, θα πρέπει να
χρησιμοποιούνται κατάλληλες προφυλάξεις και καλές εργαστηριακές πρακτικές.
Προς ιατρούς ή ιδρύματα που παραλαμβάνουν ραδιοϊσότοπα κάτω από γενική άδεια:
Το παρόν ραδιενεργό υλικό μπορεί να ληφθεί, να αποκτηθεί, να κατέχεται και να
χρησιμοποιείται μόνο από ιατρούς, κτηνίατρους που εξασκούν κτηνιατρική ιατρική,
κλινικά εργαστήρια ή νοσοκομεία και μόνο για κλινικές ή εργαστηριακές δοκιμές in vitro
που δεν περιλαμβάνουν την εσωτερική ή εξωτερική χορήγηση του υλικού, ή της
ακτινοβολίας αυτού, σε ανθρώπους και ζώα. Η παραλαβή, η απόκτηση, η κατοχή, η
χρήση και η μεταφορά υπόκεινται στους κανονισμούς και τη γενική άδεια της.
Ρυθμιστικής Επιτροπής Πυρηνικών των Η.Π.Α. (NRC) ή της πολιτείας με την οποία η
επιτροπή έχει συνάψει συμφωνία για την άσκηση καθηκόντων αρμόδιας αρχής.
1. Η φύλαξη του ραδιενεργού υλικού θα πρέπει να περιοριστεί σε ειδικά
επισημασμένο χώρο.
2. Η πρόσβαση σε ραδιενεργά υλικά πρέπει να περιοριστεί μόνο σε
εξουσιοδοτημένο προσωπικό.
3. Μη χρησιμοποιείτε πιπέτα με το στόμα για ραδιενεργά διαλύματα.
4. Μην τρώτε ή πίνετε εντός των χώρων εργασίας που έχουν επισημανθεί ως
ραδιενεργοί.
140
5. Οι περιοχές, όπου ενδεχομένως έχουν προκληθεί εκχύσεις, θα πρέπει να
σκουπιστούν και κατόπιν να πλυθούν με αλκαλικό απορρυπαντικό ή ραδιολογικό
απολυμαντικό διάλυμα. Τυχόν γυάλινα σκεύη που χρησιμοποιήθηκαν πρέπει να
εκπλυθούν καλά με νερό πριν από την πλύση άλλων εργαστηριακών γυάλινων
σκευών.
Προς ιατρούς ή ιδρύματα που παραλαμβάνουν ραδιοϊσότοπα κάτω από ειδική άδεια:
Η παραλαβή, η χρήση, η μεταφορά και η διάθεση των ραδιενεργών υλικών υπόκεινται
στους κανονισμούς και τις συνθήκες της ειδικής άδειάς σας.
ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΗ: Το προϊόν αυτό περιέχει μια χημική ουσία η οποία έχει
γνωστοποιηθεί στην πολιτεία της Καλιφόρνιας ότι προκαλεί καρκίνο.
ΠΡΟΣΟΧΗ: Η ραδιενέργεια που αναγράφεται στο ένθετο συσκευασίας μπορεί να διαφέρει
ελαφρώς από τη ραδιενέργεια που αναγράφεται στην ετικέτα συσκευασίας ή στην ετικέτα
φιαλιδίου ιχνηθέτη. Η ετικέτα συσκευασίας και η ετικέτα φιαλιδίου ιχνηθέτη υποδεικνύουν
την πραγματική ποσότητα ραδιενέργειας κατά την ημερομηνία βαθμονόμησης, ενώ το
ένθετο συσκευασίας υποδεικνύει τη θεωρητική ραδιενέργεια του κιτ.
6. ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΠΙΘΑΝΗΣ ΦΘΟΡΑΣ ΤΩΝ ΑΝΤΙΔΡΑΣΤΗΡΙΩΝ ΚΙΤ
6.1 Παρουσία ασυνήθιστων στερεών σωματιδίων σε οποιοδήποτε αντιδραστήριο.
6.2 Μετατόπιση της κλίσης ή της θέσης της καμπύλης βαθμονόμησης σε σχέση με
αυτήν που λαμβάνεται κανονικά.
6.3 Μείωση της μέγιστης δέσμευσης.
6.4 Υψηλή μη ειδική δέσμευση.
7. ΣΥΛΛΟΓΗ ΚΑΙ ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΟΡΟΥ ΚΑΙ ΤΟΥ ΠΛΑΣΜΑΤΟΣ
Το κιτ 1,25-διϋδροξυβιταμίνης D χρειάζεται 500 μL είτε ορού είτε πλάσματος EDTA για
να διεξαχθεί η εκχύλιση του προσδιορισμού. Όγκος 1,5 mL επιτρέπει την επανάληψη
της ανάλυσης και παρέχει επίσης επαρκή όγκο για διανομή με πιπέτα.
Με το κιτ αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ανθρώπινος ορός ή πλάσμα. Με τον
προσδιορισμό αυτό μπορούν να χρησιμοποιηθούν αντιπηκτικά EDTA. Συνιστάται δείγμα
από άτομα που δεν έχουν φάει, αλλά δεν απαιτείται. Η δειγματοληψία θα πρέπει να
γίνεται άσηπτα με φλεβοπαρακέντηση σε κενό υάλινο δοκιμαστικό σωλήνα 5 ή 10 mL.
Για τον ορό, αφήστε το αίμα να πήξει σε θερμοκρασία δωματίου (15 έως 25°C).
Φυγοκεντρήστε για 15 λεπτά χρησιμοποιώντας 760 x g* περίπου για να λάβετε ορό
χωρίς αιμόλυση. Δεν απαιτούνται πρόσθετα ή συντηρητικά για τη διατήρηση της
ακεραιότητας του δείγματος. λα τα πλαστικά και υάλινα σκεύη ή άλλα υλικά που
έρχονται σε επαφή με το δείγμα δεν θα πρέπει να είναι μολυσμένα.
Φυλάξτε τα δείγματα ορού ή πλάσματος στους -15°C ή χαμηλότερα. Τα δείγματα δε θα
πρέπει να καταψύχονται και να αποψύχονται επανειλημμένως. Ωστόσο, μια μελέτη που
έγινε από την DiaSorin δεν έδειξε σημαντική αλλαγή στις τιμές μετά από
3 κύκλους ψύξης - απόψυξης των δειγμάτων. Δείγματα αποθηκεύτηκαν στη DiaSorin
επί 6 μήνες στους -15°C ή χαμηλότερα χωρίς σημαντική αλλαγή στα αποτελέσματα.
8. ΕΞΟΠΛΙΣΜΟΣ ΚΑΙ ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΑΠΑΙΤΟΥΝΤΑΙ, ΟΜΩΣ ΔΕΝ ΠΑΡΕΧΟΝΤΑΙ
8.1 Οι φύσιγγες C18OH (24 φύσιγγες) παραγγέλλονται ξεχωριστά με Αρ. κατ.
DiaSorin 65101E.
8.2 Αναλώσιμα σωληνάρια από βοριοπυριτικό γυαλί, 12 x 75 mm και
13 x 100 mm.
8.3 Βάσεις δοκιμαστικών σωλήνων.
* g = (1118 x 10-8) (ακτίνα σε εκατοστά) (rpm)2
141
8.4 Parafilm ή ισοδύναμο για την κάλυψη των δοκιμαστικών σωλήνων.
8.5 Αφρώδης βάση για μετάγγιση ή αντίστοιχο υλικό.
8.6 Φυγοκεντρητής με χωρητικότητα σωλήνων 12 x 75 mm και επίτευξη
1800 x g*.
8.7 Μετρητής γάμμα με δυνατότητα μέτρησης 125I.
8.8 Όργανο περιδίνησης (vortex).
8.9 Συσκευές πιπέτας:
α. Μικροπιπέτες βαθμονομημένες να χορηγούν 75 μL, 300 μL και 500 μL.
β. Διανομείς επαναλαμβανόμενης χορήγησης, ικανοί να διανέμουν 50 μL,
300 μL, και 500 μL.
γ. Ογκομετρικές πιπέτες για την ανασύσταση των βαθμονομητών, 3,0 mL.
8.10 Απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό.
8.11 Οργανικοί διαλύτες:
Θα χρειαστούν οι παρακάτω διαλύτες για την παρασκευή και εκχύλιση των
δειγμάτων.
Χρησιμοποιείτε μόνο διαλύτες βαθμού HPLC.
Μην εκθέτετε οποιονδήποτε από τους οργανικούς διαλύτες σε υάλινα
δοχεία πλυμένα με οξέα ή τυχόν άλλες όξινες συνθήκες.
α. Ακετονιτρίλιο.
β. Μεθανόλη.
γ. Εξάνιο. (ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ: το ποσοστό του n-εξανίου πρέπει να είναι
μεγαλύτερο από 95%)
δ. Χλωριούχο μεθυλένιο (δεν πρέπει να περιέχει αλκοόλη ως συντηρητικό).
ε. Ισοπροπανόλη (2-προπανόλη).
8.12 Συνιστώμενη συσκευή για τις φύσιγγες C18OΗ:
α. Σταθμός επεξεργασίας δειγμάτων Vac Elut. Επεξεργάζεται 24 στήλες ανά
κύκλο. Διατίθεται από την Analytichem International ή την DiaSorin. Για
παραγγελία από την DiaSorin, χρησιμοποιήστε Αρ. κατ. DiaSorin 11610.
8.13 Υλικά που χρειάζονται για ξήρανση των δειγμάτων:
α. Αέριο άζωτο.
β. Πολλαπλό ξήρανσης με τμήμα θέρμανσης 37°C (±2°C) ή υδατόλουτρο:
τα N-EVAP ή MULTI-VAP διατίθενται μέσω της Organomation Associates
(Βερολίνο, MA) ή τα Reacti-Vap II και Reacti-Therm III διατίθενται μέσω της
Pierce Chemical Company (Rockford, IL).
* g = (1118 x 10-8) (ακτίνα σε εκατοστά) (rpm)2
142
9. ΠΑΡΑΣΚΕΥΗ ΤΩΝ ΟΡΓΑΝΙΚΩΝ ΔΙΑΛΥΤΩΝ ΓΙΑ ΤΗΝ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΣΤΗΛΗΣ
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα μίγματα οργανικών διαλυτών πρέπει να παρασκευάζονται πριν
την έναρξη της Προκαταρκτικής διαδικασίας εκχύλισης.
ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ:
Παρασκευάστε τα μίγματα διαλυτών όπως περιγράφεται στον ΠΙΝΑΚΑ I.Η DiaSorin
συνιστά παρασκεύασμα όγκου 500 mL. Μπορούν να παρασκευάζονται μεγαλύτεροι ή
μικρότεροι όγκοι υπό τον όρο ότι οι αναλογίες παραμένουν σταθερές. Ωστόσο, οι όγκοι
πρέπει να είναι αρκετά μεγάλοι ώστε να ελαχιστοποιείται το σφάλμα μέτρησης.
Μετράτε κάθε διαλύτη ξεχωριστά για καλύτερα αποτελέσματα.
ΠΡΟΦΥΛΑΞΕΙΣ:
Χρησιμοποιήστε απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό όπου εφαρμόζεται.
ΠΙΝΑΚΑΣ I
Παρασκευή διαλυτών
Μίγμα
διαλυτών Υλικά 1 L 500 mL
μεθανόλη 700 mL 350 mL
70:30
νερό 300 mL 150 mL
εξάνιο 900 mL 450 mL
90:10
χλωριούχο μεθυλένιο 100 mL 50 mL
εξάνιο 990 mL 495 mL
99:1
IPA 10 mL 5 mL
εξάνιο 920 mL 460 mL
92:8
IPA 80 mL 40 mL
10. ΠΡΟΚΑΤΑΡΚΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΕΚΧΥΛΙΣΗΣ
10.1 Ανασυστήστε κάθε λυοφιλιωμένο βαθμονομητή με 3,0 mL μηδενικού
βαθμονομητή. Αναμίξτε καλά τους βαθμονομητές και αφήστε τους ακίνητους επί
15-20 λεπτά ώστε να διασφαλιστεί πλήρης ανασύσταση. Αποψύξτε εντελώς
τυχόν κατεψυγμένα αντιδραστήρια. Αφήστε όλα τα αντιδραστήρια να φθάσουν σε
θερμοκρασία δωματίου. Η θερμοκρασία των αντιδραστηρίων δεν θα πρέπει να
υπερβεί τους 25°C. Αναμίξτε καλά όλα τα αντιδραστήρια πριν τη χρήση.
10.2 Διανείμετε με πιπέτα 500 μL κάθε βαθμονομητή (0-5), υλικό ελέγχου και
δείγμα ασθενή σε σημασμένους δοκιμαστικούς σωλήνες από βοριοπυριτικό
ύαλο 12 x 75 mm.
10.3 Προσθέστε 500 μL ακετονιτρίλιο σε κάθε δείγμα.Περιδινήστε με διακοπές,
τουλάχιστον 3 φορές, σε χρονική διάρκεια 10 λεπτών.
10.4 Φυγοκεντρήστε τους σωλήνες στις 760 x g* για 10 λεπτά στους 20 έως 25°C.
10.5 Μεταγγίστε τα υπερκείμενα των δειγμάτων σε σημασμένους δοκιμαστικούς
σωλήνες 12 x 75 mm ή 13 x 100 mm (αν προτιμάτε).Απορρίψτε τους
σβώλους.
* g = (1118 x 10-8) (ακτίνα σε εκατοστά) (rpm)2
143
10.6 Προσθέστε 500 μL Διαλύματος προεπεξεργασίας σε κάθε σωλήνα και
περιδινήστε.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το κιτ αυτό είναι σχεδιασμένο να χωράει έως 48 εκχυλίσεις
μεταξύ των οποίων βαθμονομητές και υλικά ελέγχου συν 40 άγνωστα
δείγματα. Αυτό σημαίνει ότι μπορεί να γίνει αμέσως εκχύλιση 24 δειγμάτων
στη συσκευή VacElut και κατόπιν μπορεί να γίνει εκχύλιση του υπολειπόμενου
συνόλου των 24 δειγμάτων.
Οι εκχυλίσεις στήλης πρέπει να γίνονται όσο το δυνατόν συντομότερα μετά την
προσθήκη διαλύματος προεπεξεργασίας. Ωστόσο, μόλις γίνει εκχύλιση της
στήλης, τα δείγματα μπορούν να αποθηκευτούν επί 96 ώρες στους -15°C ή
χαμηλότερα.
10.7 Τα δείγματα είναι πλέον έτοιμα προς εφαρμογή στις φύσιγγες C18OH.
11. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΣΤΗΛΗΣ
11.1 Για επεξήγηση της συσκευής VAC ELUT, ανατρέξτε στον Οδηγό χρήστη VAC
ELUT. Συναρμολογήστε το σταθμό σύμφωνα με τις οδηγίες.
11.2 Σημάνετε με ετικέτα ένα σωλήνα από βοριοπυριτικό ύαλο 13 x 100 mm για
κάθε βαθμονομητή (0-5), υλικό ελέγχου και άγνωστο δείγμα. Τοποθετήστε
τους σωλήνες αυτούς στη συσκευή VAC ELUT. Βεβαιωθείτε ότι το καπάκι του
VAC ELUT βρίσκεται στη θέση “ΑΠΟΒΛΗΤΑ” και ότι οι σωλήνες είναι
τοποθετημένοι έτσι ώστε να συλλέγουν τα επιθυμητά προϊόντα έκλουσης.
Τοποθετήστε τις φύσιγγες C18OH στο κάλυμμα του VAC ELUT.
11.3 Προσθέστε τα μίγματα διαλυτών στην καθορισμένη φύσιγγα όπως
περιγράφεται στον ΠΙΝΑΚΑ II.
ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ:
Χρήση κενού:
Ενεργοποιήστε το κενό μετά από την προσθήκη κάθε διαλύτη και αφήστε το μίγμα
του διαλύτη να διέλθει εντελώς μέσω της φύσιγγας πριν προχωρήσετε στον
επόμενο διαλύτη. Ενεργοποιήστε και απενεργοποιήστε το κενό κατά τα
συνιστώμενα βήματα στον ΠΙΝΑΚΑ II (αν προτιμάτε, το κενό μπορεί να
απενεργοποιείται μεταξύ κάθε προσθήκης διαλύτη). Το κενό πρέπει να ρυθμιστεί
στις 10 ίντσες (254 mm Hg) ή χαμηλότερα. Εκλούστε κάθε μίγμα διαλύτη μέσω
της εξόδου “ΑΠΟΒΛΗΤΑ” και μέσα στα κατάλληλα δοχεία αποβλήτων μέχρι το
βήμα τελικής συλλογής.
Εφαρμογή δείγματος:
Τα δείγματα μπορούν είτε να μεταγγιστούν απευθείας στη φύσιγγα είτε να
εφαρμοστούν με πιπέτα.
Μη αφήσετε τις φύσιγγες να στεγνώσουν στον αέρα για περισσότερα από
5 λεπτά μεταξύ εφαρμογών.
Προεπεξεργασία φυσίγγων C18OH:
Οι φύσιγγες C18OH πρέπει να πλένονται με 5 mL σε αναλογία 90:10 (εξάνιο:
χλωριούχο μεθυλένιο), 5 mL IPA και 5 mL μεθανόλη πριν από την πρώτη χρήση.
Το μίγμα του διαλύτη 90:10 (εξάνιο: χλωριούχο μεθυλένιο) μπορεί να
παρασκευαστεί με την μέτρηση 900 mL εξανίου και 100 mL χλωριούχου
μεθυλενίου. Τοποθετήστε τις καινούριες, αχρησιμοποίητες φύσιγγες στη συσκευή
VAC ELUT, ρυθμίστε στη θέση “ΑΠΟΒΛΗΤΑ”, και προσθέστε 5 mL 90:10 (εξάνιο:
χλωριούχο μεθυλένιο) και στη συνέχεια 5 mL IPA σε κάθε στήλη και κατόπιν
5 mL μεθανόλη. Αφήστε κάθε μίγμα διαλύτη να διέλθει εντελώς από τις φύσιγγες
πριν προχωρήσετε στο επόμενο μίγμα. Μετά από την αρχική αυτή παρασκευή,
δεν θα είναι απαραίτητο να επαναλάβετε το βήμα αυτό αφού η φύσιγγα
ανανεώνεται κατά τη διαδικασία εξαγωγής.
144
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Αν πρόκειται να εκχυλιστούν πρόσθετα δείγματα (άνω των 24),
ανανεώστε τις φύσιγγες με χρήση της ίδιας μεθόδου που αναφέρεται στον
ΠΙΝΑΚΑ II. Οι φύσιγγες μπορούν να χρησιμοποιηθούν και πάλι έως 30 φορές.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Το υλικό της φύσιγγας C18OH συγκρατείται στη θέση του με χρήση
πορώδους κεραμικής ίνας. Απορρίψτε φύσιγγες με μετατοπισμένες ή ελλιπείς
κεραμικές ίνες διότι ενδέχεται να απωλεσθεί το υλικό C18OH.
ΠΙΝΑΚΑΣ ΙΙ
Περιγραφή και ανάλυση
εκχύλισης
Βήματα εκχύλισης Χειρισμός
εκλούοντος μέσου
1. Προσθέστε 1 mL μεθανόλης,
ενεργοποιήστε το κενό.
Η προετοιμασία/ανανέωση
στήλης αφαιρεί: Παρεμβαλλόμενες
ουσίες από προηγούμενη χρήση
(βήμα 1) 2. Απενεργοποιήστε το κενό.
Απορρίψτε
“ΑΠΟΒΛΗΤΑ”
Εφαρμογή δείγματος 3. Εφαρμόστε όλα τα δείγματα,
ενεργοποιήστε το κενό. από την
Προκαταρκτική διαδικασία
εκχύλισης (βήμα 10).
Απορρίψτε
“ΑΠΟΒΛΗΤΑ”
Κάθαρση/Αφαίρεση
μεταβολιτών βιταμίνης D
4. Προσθέστε 5 mL 70:30
μεθανόλη/νερό (απεσταγμένο
ή απιονισμένο).
Αφαιρεί: Παρεμβαλλόμενα πολικά
λιπίδια, άλατα, και χρωστικές
(βήμα 4).
5. Προσθέστε 5 mL 90:10
εξάνιο/χλωριούχο μεθυλένιο.
25(OH)D (Βήμα 5) 6. Προσθέστε 5 mL 99:1
εξάνιο/ισοπροπανόλη.
Υπολειπόμενη 25(OH)D και 24,25(OH)2
D/25,26(OH)2 D (βήμα 6)
7. Απενεργοποιήστε το κενό.
Απορρίψτε
“ΑΠΟΒΛΗΤΑ”
Συλλογή 1,25-(OH)2D ΣΗΜΑΝΤΙΚΟ!
Έκλουση κεκαθαρμένης 1,25-(OH)2 D
(βήμα 9)
8. Αλλάξτε τη ρύθμιση του Vac
Elut σε “Συλλογή:”
9. Προσθέστε 3 mL 92:8
εξάνιο/ισοπροπανόλη,
ενεργοποιήστε το κενό.
10. Απενεργοποιήστε το κενό.
“ΣΥΛΛΟΓΗ”
145
12. ΞΗΡΑΝΣΗ ΚΑΙ ΑΝΑΣΥΣΤΑΣΗ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ ΕΚΛΟΥΣΗΣ
12.1 Τοποθετήστε τους σωλήνες των δειγμάτων που περιέχουν τα προϊόντα
έκλουσης σε τμήμα θέρμανσης ή υδατόλουτρο στους 37°C (±2°C) για ξήρανση.
12.2 Στεγνώστε τα προϊόντα έκλουσης κάτω από αποροφητήρα με χρήση 2-4 psi
αέριου αζώτου (χρόνος ξήρανσης 20-30 λεπτά).
12.3 Αφαιρέστε αμέσως τους σωλήνες αφού στεγνώσει το προϊόν έκλουσης.
12.4 Ανασυστήστε καθένα από τα στεγνά εκχυλίσματα με 50 μL αιθανόλης 95%.
Περιδινήστε μαλακά σε χαμηλή έως μέτρια ταχύτητα. Προσθέστε 125 μL
ιχνηθέτη στους ίδιους σωλήνες που περιέχουν τα 50 μL της αιθανόλης 95%,
περιδινήστε και πάλι μαλακά σε χαμηλή έως μέτρια ταχύτητα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Τα
βήματα περιδίνησης είναι πολύ σημαντικά για να διασφαλιστεί ότι το δείγμα
έχει ανασυσταθεί σωστά και για να υπάρξει υψηλή ακρίβεια.
ΠΡΟΣΟΧΗ: Διατηρήστε την περιδίνηση στο χαμηλότερο τμήμα του σωλήνα
ώστε να εμποδιστεί η απώλεια του όγκου του δείγματος διασφαλίζοντας έτσι
επαρκή όγκο διανομής με πιπέτα για τον προσδιορισμό. Σημάνετε με ετικέτα
έναν πρόσθετο σωλήνα για τη Συνολική μέτρηση και ένα σωλήνα για NSB.
Προσθέστε 50 μL αιθανόλης 95% και 125 μL ιχνηθέτη και στους δύο σωλήνες.
Αυτοί θα χρησιμοποιηθούν για δημιουργία εφεδρικών σωλήνων TC (Συνολική
μέτρηση) και NSB για τη ρύθμιση του προσδιορισμού.
12.5 Εκτελέστε τον προσδιορισμό αμέσως μετά από την ανασύσταση των δειγμάτων.
Για καλύτερα αποτελέσματα κατά την εκτέλεση μεγαλύτερων προσδιορισμών,
ανασυστήστε 12 - 15 δείγματα κάθε φορά και εν συνεχεία διανείμετε με πιπέτα
στον προσδιορισμό πριν ανασυστήσετε τα επόμενα 12 - 15 δείγματα.
13. ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗΣ
13.1 Τακτοποιήστε τους σημασμένους, αναλώσιμους σωλήνες από βοριοπυριτικό
γυαλί 12 x 75 mm εις διπλούν για κάθε βαθμονομητή (0-5), υλικό ελέγχου και
δείγμα σύμφωνα με το σχέδιο του προσδιορισμού. Προσθέστε προσεκτικά
75 μL του ανασυσταθέντος βαθμονομητή, υλικού ελέγχου και των
εκχυλισμάτων δείγματος στους διπλούς σωλήνες προσδιορισμού.
ΠΡΟΣΟΧΗ: Το βήμα αυτό πρέπει να εκτελείται προσεκτικά διότι υπάρχει
περίσσεια μόνο 25 μL σε κάθε σωλήνα.
13.2 Ανατρέξτε στο “Ξήρανση και ανασύσταση προϊόντων έκλουσης”, αριθμός
βήματος 4. Προσθέστε 75 μL από το σωλήνα TC (Συνολική μέτρηση) στους
διπλούς σωλήνες προσδιορισμού. Επαναλάβετε το βήμα αυτό και για τους
διπλούς σωλήνες προσδιορισμού NSB.
13.3 Προσθέστε 300 μL ρυθμιστικού διαλύματος NSB στους σωλήνες NSB.
13.4 Προσθέστε 300 μL πρωτοταγούς αντισώματος σε όλους τους σωλήνες εκτός
από τους σωλήνες Συνολικής μέτρησης και NSB.
13.5 Αναμίξτε καλά. Επωάστε επί 2 ώρες (±15 λεπτά) στους 20-25°C.
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Εκτελέστε ανασύσταση του Σύμπλοκου καθίζησης GAR με
35 mL απεσταγμένο ή απιονισμένο νερό. Αναμίξτε εντελώς έως ότου το
εναιώρημα να εμφανιστεί ομοιογενές και έπειτα αφήστε το ακίνητο για
τουλάχιστον 30 λεπτά πριν από τη χρήση σε θερμοκρασία δωματίου
ανακινώντας το περιστασιακά πριν και κατά τη διάρκεια της χρήσης.
13.6 Προσθέστε 500 μL καλά αναμεμιγμένου Σύμπλοκου καθίζησης GAR σε όλους
τους σωλήνες εκτός από τους σωλήνες Συνολικής μέτρησης. Επωάστε επί
20 λεπτά (±5 λεπτά) στους 20-25°C.
146
13.7 Φυγοκεντρήστε όλους τους σωλήνες για 20 λεπτά στους 20 έως 25°C στα
1800 x g*, εκτός από τους σωλήνες Συνολικής μέτρησης.
13.8 Μεταγγίστε τα υπερκείμενα, εκτός από αυτά των σωλήνων Συνολικής
μέτρησης, χρησιμοποιώντας μια αφρώδη βάση δοκιμαστικών σωλήνων, ή
αντίστοιχο, αναστρέφοντας τη βάση σε ένα κατάλληλο δοχείο αποβλήτων.
Τοποθετήστε την ανεστραμμένη βάση σε απορροφητικό χαρτί για 2 έως
3 λεπτά. Σκουπίστε τους δοκιμαστικούς σωλήνες απαλά για να εξασφαλίσετε
ότι έχει απομακρυνθεί όλο το υγρό.
13.9 Μετρήστε τη ραδιενέργεια με μέτρηση όλων των σωλήνων επί 1 λεπτό σε
μετρητή γάμμα. Οι δοκιμαστικοί σωλήνες θα πρέπει να μετρηθούν για 1 λεπτό
ή περισσότερο (βλ. παράγραφο Περιορισμοί της διαδικασίας).
14. ΔΙΑΔΙΚΑΣΤΙΚΑ ΣΧΟΛΙΑ
14.1 Προσθέστε κάθε κλάσμα αντιδραστηρίου στο χαμηλότερο τρίτο του
δοκιμαστικού σωλήνα προκειμένου να εξασφαλιστεί η πλήρης ανάμιξη των
αντιδραστηρίων.
14.2 Οι σωστές αναλογίες των διαλυτών είναι κρίσιμης σημασίας για καλή
ανάκτηση. Παρασκευάστε διαλύματα σε όγκους αρκετά μεγάλους ώστε να
ελαχιστοποιείται το σφάλμα μέτρησης.
14.3 Αν οποιοδήποτε δείγμα είναι μεγαλύτερο από το βαθμονομητή με την
υψηλότερη τιμή, πρέπει να αραιωθεί με το μηδενικό βαθμονομητή του κιτ και
να γίνει ξανά ο προσδιορισμός του πριν από την εκχύλιση. Τα αποτελέσματα
πρέπει να πολλαπλασιαστούν με τον κατάλληλο παράγοντα αραίωσης. Για
παράδειγμα, αναμίξτε 500 μL του δείγματος με 500 μL του μηδενικού
βαθμονομητή, και κατόπιν εκτελέστε τον προσδιορισμό 500 μL του δείγματος
αυτού σύμφωνα με το ένθετο του προϊόντος.
14.4 Δεν παρατηρήθηκε μετατόπιση προσδιορισμού στο μέσο χρόνο που
χρειάζεται για να εκτελεστεί προσδιορισμός 100 σωλήνων.
14.5 Για να παρακολουθεί πλήρως ένα εργαστήριο τη συνεπή απόδοση ενός
ραδιοανοσοπροσδιορισμού (RIA), υπάρχουν πρόσθετοι παράγοντες που
ενδέχεται να ελέγχονται. Η DiaSorin προτείνει τακτικό έλεγχο των παρακάτω
παραμέτρων για να εξασφαλιστεί η συνεπής απόδοση του κιτ.
α. Συνολικές μετρήσεις
β. Μέγιστη δέσμευση
Μέση τιμή μετρήσεων ανά λεπτό (CPM) των δοκιμαστικών σωλήνων
βαθμονομητή 0 /Μέση τιμή CPM των δοκιμαστικών σωλήνων συνολικών
μετρήσεων.
γ. Μη ειδική δέσμευση
Μέση τιμή CPM των δοκιμαστικών σωλήνων NSB/Μέση τιμή CPM των
δοκιμαστικών σωλήνων συνολικών μετρήσεων.
δ. Κλίση της καμπύλης βαθμονόμησης
Μπορεί να γίνει παρακολούθηση της καταστολής 50%.
* g = (1118 x 10-8) (ακτίνα σε εκατοστά) (rpm)2
147
15. ΠΟΙΟΤΙΚΟΣ ΕΛΕΓΧΟΣ
Κάθε εργαστήριο πρέπει να περιλαμβάνει τουλάχιστον δυο υλικά ελέγχου (ένα υλικό
ελέγχου φυσιολογικού εύρους και ένα αυξημένου εύρους) σε κάθε προσδιορισμό ώστε
να παρακολουθείται η απόδοση του κιτ. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν εμπορικά
διαθέσιμοι υλικά ελέγχου ή 2 υλικά ελέγχου αναφοράς που παρέχονται με το κιτ.
Ο χειρισμός των υλικών ελέγχου θα πρέπει να γίνεται ως εάν ήταν άγνωστα δείγματα
και ο προσδιορισμός τους θα πρέπει να γίνεται δύο φορές. Θα πρέπει να τηρούνται
πίνακες ποιοτικού ελέγχου από το εργαστήριο για να παρακολουθείται η απόδοση των
υλικών ελέγχου. Κάθε ξεχωριστό εργαστήριο θα πρέπει να καθορίζει αποδεκτά όρια
απόδοσης για κάθε επίπεδο μαρτύρων χρησιμοποιώντας μεθόδους βασισμένες στη
στατιστική και σχεδιασμένες για να ανιχνεύουν τόσο συστηματικά όσο και τυχαία
σφάλματα. Τα αποτελέσματα των υλικών ελέγχου θα πρέπει να ικανοποιούν τα
κριτήρια του εργαστηρίου για αποδεκτικότητα πριν από την αναφορά των
αποτελεσμάτων της δοκιμής των ασθενών.12,13,14
16. ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ
Υπάρχουν πολλές μέθοδοι για τον υπολογισμό αποτελεσμάτων
ραδιοανοσοπροσδιορισμών. Κάθε μία βασίζεται στη λήψη καμπύλης βαθμονόμησης με
το σχεδιασμό του βαθμού δέσμευσης συναρτήσει των δηλωμένων συγκεντρώσεων
βαθμονομητών. Το γράφημα αυτό μπορεί να σχεδιαστεί σε γραμμική ή λογαριθμική
κλίμακα. Κάθε μία από αυτές τις μεθόδους δίδει ουσιαστικά τις ίδιες τιμές για υλικά
ελέγχου και δείγματα, αν και ορισμένοι προσδιορισμοί ενδέχεται να “προσαρμόζονται”
καλύτερα σε μια συγκεκριμένη μέθοδο από μία άλλη. Η μέθοδος υπολογισμού για το
εργαστήριο ποιοτικού ελέγχου της DiaSorin είναι %B/B0 έναντι της μεθόδου
υπολογισμού λογαριθμημένης συγκέντρωσης με βάση προσαρμογή καμπύλης smooth
spline.
16.1 Υπολογισμός ποσοστού B/B0
α. Υπολογίστε τον μέσο CPM για κάθε βαθμονομητή, υλικό ελέγχου και
άγνωστο δείγμα.
β. Αφαιρέστε τη μέση τιμή CPM των δοκιμαστικών σωλήνων NSB από όλες
τις μετρήσεις.
γ. Διαιρέστε το μέσο διορθωμένο CPM για κάθε βαθμονομητή, υλικό
ελέγχου ή άγνωστο δείγμα με το μέσο διορθωμένο CPM του
βαθμονομητή 0 και πολλαπλασιάστε με 100.
μέση τιμή CPM (Βαθμονομητής ή Άγνωστο δείγμα) - μέση τιμή CPM (NSB)
μέση τιμή CPM (Βαθμονομητής 0) - μέση τιμή CPM (NSB)
x 100 = B/B0 (%)
16.2 Χρήση Σχεδίου καμπύλης βαθμονομητή
α. Με χρήση χαρτιού log-logit ή ημιλογαριθμικού γραφήματος 2 κύκλων,
σχεδιάστε το ποσοστιαίο B/B0 (%) για τους βαθμονομητές 1,25 (OH)2D
στην τεταγμένη (άξονας ψ) έναντι της συγκέντρωσης βαθμονομητή στην
τετμημένη (άξονας χ).
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Για την ανάλυση των δεδομένων, μπορείτε επίσης να
χρησιμοποιήσετε προγράμματα αυτοματοποιημένης αναγωγής δεδομένων. Η
DiaSorin χρησιμοποιεί Multi-Calc (Pharmacia) με πρόγραμμα προσαρμογής
LIN-LOG smooth-SPLINE. Άλλες μέθοδοι αναγωγής δεδομένων πρέπει να
εγκριθούν πριν ενσωματωθούν για κανονική χρήση.
148
β. Σχεδιάστε την καμπύλη που προσαρμόζεται καλύτερα στα σημεία.
γ. Παρεμβάλετε τα επίπεδα της 1,25-(OH)2D στα δείγματα από την
καταγραφή των βαθμονομητών.
δ. Αν αραιωθεί ένα άγνωστο δείγμα, διορθώστε για να συμπεριλάβετε τον
κατάλληλο συντελεστή αραίωσης.
ε. Το αναφερόμενο εύρος του προσδιορισμού είναι 5,0 pg/mL έως
200 pg/mL. Οποιαδήποτε τιμή που είναι μικρότερη από το χαμηλότερο
βαθμονομητή, 5,0 pg/mL, είναι μια παρεμβαλλόμενη τιμή και μπορεί να
αναφερθεί ως “μικρότερο του 5 pg/mL”.
στ. Υπολογίστε τη μέγιστη δέσμευση διαιρώντας το CPM του βαθμονομητή 0
με τη μέση τιμή συνολικών μετρήσεων που λήφθηκαν στους
δοκιμαστικούς σωλήνες συνολικών μετρήσεων.
Στον ΠΙΝΑΚΑ IV και στο ΣΧΗΜΑ 1 παρουσιάζονται τυπικά δεδομένα δείγματος για την
ανάλυση 1,25-(OH)2D RIA. Οι πληροφορίες αυτές δίδονται μόνο για αναφορά και δεν
πρέπει να χρησιμοποιηθούν για τον υπολογισμό καμίας τιμής.
ΠΙΝΑΚΑΣ IV
Δεδομένα δείγματος DiaSorin 1,25-(OH)2D RIA
Σωλήνας
Διπλό
CPM
Μέσος
όρος
CPM
Διορθωμένο
CPM
Ποσοστιαίο
Δεσμευμένο
(B/T)
Ποσοστιαίο
(B/B0)
Συγκέντρωση
(pg/mL)
Συνολική μέτρηση 40.792 40.685
40.578
NSB 1.438 1.439 3,5
1.439
Βαθμονομητής 0 18.006 18.063 16.624 44,4 100,0
18.119
Βαθμονομητές
(pg/mL)
1 (5,0) 16.710 16.740 15.302 92,0
16.770
2 (15,0) 14.941 14.929 13.490 81,2
14.916
3 (30,0) 13.087 13.106 11.667 70,2
13.124
4 (75,0) 9.820 9.793 8.354 50,2
9.765
5 (200) 6.412 6.438 5.000 30,0
6.464
Υλικά ελέγχου
Επίπεδο 1: 13.275 13.403 11.964 72,0 27,3
φυσιολογικό εύρος 13.530
Επίπεδο 2: 8.206 8.165 6.727 40,5 119
υψηλό εύρος: 8.124
149
Καμπύλη βαθμονόμησης δείγματος DiaSorin 1,25-(OH)2D RIA
ΣΧΗΜΑ 1
ΑΝΑΓΩΓΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ
Το εργαστήριο ποιοτικού ελέγχου της DiaSorin χρησιμοποιεί προσαρμογή καμπύλης
smooth spline.
17. ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΙ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑΣ
17.1 Οι χρόνοι μέτρησης θα πρέπει να είναι αρκετά μεγάλοι για να εμποδίζεται το
σφάλμα εξαιτίας ανεπάρκειας του μετρητή (για παράδειγμα, η συσσώρευση
2.000 CPM θα αποδώσει σφάλμα 5%, ενώ 10.000 CPM θα αποδώσουν σφάλμα
1%).
17.2 Τα αποτελέσματα της ανάλυσης θα πρέπει να χρησιμοποιούνται από κοινού με
άλλα κλινικά και εργαστηριακά δεδομένα για να βοηθήσουν τον κλινικό ιατρό στη
λήψη αποφάσεων που αφορούν τη διαχείριση μεμονωμένων ασθενών.
17.3 Τα χαρακτηριστικά απόδοσης του προσδιορισμού αυτού δεν έχουν καθιερωθεί
σε παιδιατρικό πληθυσμό.
18. ΑΝΑΜΕΝΟΜΕΝΕΣ ΤΙΜΕΣ
Διάστημα αναφοράς για φυσιολογικούς δότες
Είναι σημαντικό κάθε εργαστήριο να υπολογίσει το δικό του διάστημα αναφοράς το οποίο είναι
αντιπροσωπευτικό του συνήθους πληθυσμού του. Ωστόσο, οι τιμές 1,25-(OH)2D συλλέγησαν
από 123 φαινομενικά υγιείς εθελοντές από τρεις πόλεις των μεσοδυτικών Η.Π.Α. σε κλινική
δοκιμή που έγινε σε τρία κέντρα στη διάρκεια των θερινών και φθινοπωρινών μηνών. Αυτοί οι
123 υγιείς δότες ήταν μια ομάδα φυλετικά διαφορετικών ατόμων, εκ των οποίων 37 άνδρες και
86 γυναίκες, με ηλικιακό εύρος 21-68 έτη. Η μέση τιμή 1,25-(OH)2D για το σύνολο του
δείγματος (n=123) ήταν 43,9 pg/mL. Το διάστημα αναφοράς 95%, που υπολογίστηκε με μη
παραμετρική μέθοδο (σύμφωνα με τις οδηγίες C28-A215), ήταν 25,1-66,1 pg/mL.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 10 100 1000
pg/mL
% B/Bo
150
Ασθενείς με νεφρική νόσο τελικού σταδίου
Διεξήχθη μια κλινική δοκιμή για την αξιολόγηση των επιπέδων 1,25-(OH)2D που θα
υπήρχαν σε πληθυσμό ενηλίκων με διάγνωση νεφρικής νόσου τελικού σταδίου. Ένα
σύνολο 87 εθελοντών τέτοιου είδους (49 άνδρες, 38 γυναίκες, ηλικιακό εύρος 19-84)
από τρεις μεσοδυτικές πόλεις των Η.Π.Α. συγκεντρώθηκαν και υπεβλήθησαν σε
προσδιορισμό. Το παρατηρούμενο εύρος τιμών 1,25-(OH)2D για το δείγμα αυτό (n=87)
ήταν 1,6-17,3 pg/mL. Το ανώτερο όριο αναφοράς 95% που υπολογίστηκε με τη μη
παραμετρική διαδικασία είναι 14,2 pg/mL.
19. ΕΙΔΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΙΚΑ ΑΠΟΔΟΣΗΣ
19.1 Ακρίβεια
Η ακρίβεια του προσδιορισμού υπολογίστηκε από την DiaSorin με βάση τις αρχές της
Οδηγίας CLSI (EP5-A).16 Τρία επίπεδα ελέγχου με βάση ανθρώπινο ορό με
συγκεντρώσεις 1,25-(OH)2-D κατανεμημένα σε όλο το εύρος του προσδιορισμού
υπεβλήθησαν στον προσδιορισμό για διάρκεια 25 ημερών προσδιορισμού,
καλύπτοντας περισσότερες από 60 ημέρες λειτουργίας. Συμπεριελήφθησαν πολλοί
τεχνικοί καθώς και οι αριθμοί πολλών παρτίδων για όλα τα συστατικά μέρη. Τα
συνδυασμένα αποτελέσματα αξιολογήθηκαν με ανάλυση της διακύμανσης (ANOVA)
και συνοψίζονται στον παρακάτω πίνακα.
Ακρίβεια Εντός
της Ανάλυσης
Μεταξύ
ημερών
Σύνολο
Δείγμα N
Μέσος
pg/ml Τ.Α. %CV Τ.Α. %CV Τ.Α. %CV
ΧΑΜΗΛΗ 25 25,8 1,76 6,8 3,8 14,6 4,0 15.3
ΜΕΣΑΙΑ 25 41,3 3,16 7,7 4,6 11,1 5,1 12,3
ΥΨΗΛΗ 25 105,2 11,86 11,3 11,8 11,2 14,4 13,7
19.2 Αληθινότητα: Η αληθινότητα προσδιορισμού ελέγχθηκε με τη δοκιμή
γραμμικότητας και τη δοκιμή ανάκτησης.
Γραμμικότητα (Παραλληλισμός)
Η γραμμικότητα της αραίωσης εκτιμήθηκε από την DiaSorin σύμφωνα με τις συστάσεις
της Οδηγίας CLSI, EP6-P.17 Προετοιμάστηκαν τρία μίγματα δειγμάτων ορού ασθενών
με διαδοχική αραίωση με μηδενικό βαθμονομητή και δόσεις που καταψύχθηκαν
μεμονωμένα στους -20°C. Κάθε δείγμα και αραίωση υποβλήθηκε σε προσδιορισμό
πολλών αντιγράφων σε τρεις διαφορετικές ημερομηνίες προσδιορισμού. Οι
αναμενόμενες τιμές καθορίστηκαν από τις μη αραιωμένες τιμές κάθε μίγματος
δείγματος πολλαπλασιασμένες με τον παράγοντα αραίωσης.
151
Τα δεδομένα συνοψίζονται παρακάτω και τα σύνθετα αποτελέσματα σχεδιάζονται ως
γραμμική παλινδρόμηση των Αναμενόμενων έναντι των Παρατηρούμενων τιμών.
Δείγμα # Αραίωση
Αναμενόμενη τιμή
(pg/mL) (N=10)
Μέση παρατηρούμενη
τιμή (pg/mL) (N=10)
ΜΗ ΑΡΑΙΩΜΈΝΟ 49,6 49,6
1:2 24,8 25,3
1:4 12,4 11,1
1
1:8 6,2 4,4
ΜΗ ΑΡΑΙΩΜΈΝΟ 50,2 50,2
1:2 25,1 24,2
1:4 12,6 12,2
2
1:8 6,3 4,6
ΜΗ ΑΡΑΙΩΜΈΝΟ 62,0 62,0
1:2 31 31,9
1:4 15,5 13,4
3
1:8 7,8 6,2
Ανάκτηση
Η ικανότητα του προσδιορισμού να ανακτήσει ποσοτικά όλη την αναλυόμενη ουσία
που είναι παρούσα στα κλινικά δείγματα αξιολογήθηκε με την προσθήκη διαφορετικών
ποσοτήτων πρόσφατα παρασκευασθέντος, καθαρού αντιγόνου 1,25-(OH)2-D σε τρία
μίγματα δειγμάτων ασθενή. Επελέγησαν τρεις συγκεντρώσεις και υπεβλήθησαν σε
προσδιορισμό εις διπλούν, και καθορίστηκε η ποσοστιαία ανάκτηση. Η μέση
ποσοστιαία ανάκτηση με τη μέθοδο αυτή ήταν 101%.
Αρ.
δείγματος
Αρχ. Συγκ.
(pg/mL)
1,0 mL
Ποσότητα
αιχμής (pg)
*Αναμενόμενη
(pg/mL)
Παρατηρούμενη
(pg/mL)
%
Ανάκτησης
50,0 77,7 75,6 97
1 30,8 62,5 88,9 87,2 98
75,0 99,8 103 103
50,0 89,2 89,5 100
2 42,8 62,5 100,3 98,9 99
75,0 111,0 118 106
50,0 86,8 83,9 97
3 40,3 62,5 97,9 103 105
75,0 108,8 118 108
*Ο υπολογισμός αναμενόμενης συγκέντρωσης περιλαμβάνει τον παράγοντα αραίωσης
που εισήχθη στο διάλυμα πρόσθετου.
152
19.3 Αναλυτική ευαισθησία
Έχει αποδειχτεί ότι η ευαισθησία του προσδιορισμού αυτού, όταν ορίζεται ως η
χαμηλότερη ποσότητα που διαφοροποιείται από το μηδέν σε 2 αποκλίσεις του
βαθμονομητή κάτω από τη μέση τιμή cpm του μηδενικού βαθμονομητή (n = 20), είναι
<2,0 pg/mL.
19.4 Αναλυτική ειδικότητα
Τα δεδομένα της διασταυρούμενης αντιδραστικότητας του αντιορού που
χρησιμοποιείται στο κιτ αυτό εκφράζεται ως ο λόγος της συγκέντρωσης 1,25-(OH)2D3
προς τη συγκέντρωση της ουσίας με διασταυρούμενη αντιδραστικότητα σε 50%
αναστολή της μέγιστης δέσμευσης.
Αναλυόμενη ουσία Συγκ. Στο 50% B/Bo % Διασταυρούμενης
αντιδραστικότητας
24,25 D3 76.420 pg/mL <0,5
25,26 D3 24.330 pg/mL <0,5
25 D3 >>>1 mg/mL <0,5
19.5 Παρεμβαλλόμενες Ουσίες
Διεξήχθη μελέτη παρεμβολής για να καθοριστεί αν αυξημένα επίπεδα κοινών
ενδογενών ουσιών θα μπορούσαν να έχουν αρνητική επίδραση στα αποτελέσματα του
προσδιορισμού. Η αξιολόγηση έγινε σύμφωνα με τις Οδηγίες CLSI (EP7-P).18 Τρία
ανθρώπινα δείγματα με βάση ορό που περιείχαν χαμηλά, μέτρια ή υψηλά επίπεδα
1,25-(OH)2-D3 δοκιμάστηκαν είτε με προσθήκες της ουσίας υπό δοκιμή είτε ως υλικά
ελέγχου με εμπλουτισμό με πανομοιότυπους όγκους του μέσου της ουσίας υπό δοκιμή.
Έγινε εκχύλιση κάθε δείγματος δυο φορές με παραγωγή τεσσάρων πανομοιότυπων.
Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται παρακάτω αποδεικνύουν ότι δεν υπήρξε καμία
παρεμβολή από οποιαδήποτε από τις ουσίες υπό δοκιμή, όπως καθορίστηκαν με
στατιστική δοκιμή με ANOVA (διάστημα εμπιστοσύνης 95%), ή με τη μέση τιμή των
εμπλουτισμένων δειγμάτων που υπερβαίνουν τα εύρη απόκλισης βαθμονομητή ± 2
που βρέθηκαν για τα υλικά ελέγχου.
Χολερυθρίνη
Αρ.
δείγματος
Μέσος όρος
υλικού
ελέγχου
(pg/mL)
Εύρος Τ.Α.
Υλικού
ελέγχου 2
Μέσος όρος
χολερυθρίνης
(pg/mL)
Παρεμβολή
ANOVA
Χαμηλή 19,9 18,5-21,3 19,5 0,54
Μεσαία 31,7 27,7-35,7 29,9 0,22
Υψηλή 79,7 63,5-95,9 83,2 0,45
Χοληστερόλη
Αρ.
δείγματος
Μέσος όρος
υλικού
ελέγχου
(pg/mL)
Εύρος Τ.Α.
Υλικού
ελέγχου 2
Μέσος όρος
χοληστερόλης
(pg/mL)
Παρεμβολή
ANOVA
Χαμηλή 19,9 18,5-21,3 19,4 0,64
Μεσαία 31,7 27,7-35,7 29,7 0,15
Υψηλή 79,7 63,5-95,9 75,2 0,40
153
Τριγλυκερίδια
Αρ.
δείγματος
Μέσος όρος
υλικού
ελέγχου
(pg/mL)
Εύρος Τ.Α.
Υλικού
ελέγχου 2
Μέσος όρος
τριγλυκεριδίων
(pg/ml)
Παρεμβολή
ANOVA
Χαμηλή 14,7 12,9-16,5 15,1 0,88
Μεσαία 30,4 22,4-38,4 33,4 0,25
Υψηλή 92,6 69,5-116,9 95,4 0,68
Αιμοσφαιρίνη
Αρ.
δείγματος
Μέσος όρος
υλικού
ελέγχου
(pg/mL)
Εύρος Τ.Α.
Υλικού
ελέγχου 2
Μέσος όρος
αιμοσφαιρίνης
(pg/mL)
Παρεμβολή
ANOVA
Χαμηλή 21,5 17,5-25,5 20,8 0,53
Μεσαία 38,6 35,4-41,8 40,0 0,43
Υψηλή 112,7 101,4-124,0 120,6 0,17
Ουρία
Αρ.
δείγματος
Μέσος όρος
υλικού
ελέγχου
(pg/mL)
Εύρος Τ.Α.
Υλικού
ελέγχου 2
Μέσος όρος
ουρίας (pg/ml)
Παρεμβολή
ANOVA
Χαμηλή 25,1 20,9-29,3 26,6 0,39
Μεσαία 36,2 23,8-48,6 35,9 0,96
Υψηλή 120,1 97,4-142,8 118,6 0,82
ΓΙΑ ΤΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ, ΑΝΑΤΡΕΞΤΕ ΣΤΗΝ ΤΕΛΕΥΤΑΙΑ ΣΕΛΙΔΑ
154
ΣΧΕΔΙΟ ΤΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ
1. Οι βαθμονομητές, τα υλικά ελέγχου και τα άγνωστα δείγματα ανασυστήνονται
όλα με αιθανόλη 95% και ιχνηθέτη μετά από το βήμα ξήρανσης της
διαδικασίας στήλης.
2. Κατανέμετε τα αντιδραστήρια σύμφωνα με το ακόλουθο σχήμα:
Σωλήνες/Αντιδραστήρια
Συνολικές
μετρήσεις NSB
Βαθ
0-5
Υλικά ελέγχου
και άγνωστα
δείγματα
Ανασυσταθέντες
βαθμονομητές - - 75 μL -
Ανασυσταθέντα υλικά
ελέγχου και Άγνωστα
δείγματα
- - - 75 μL
Αιθανόλη 95% και
Ιχνηθέτης **
75 μL 75 μL - -
Ρυθμιστικό διάλυμα NSB - 300 μL - -
1,25-(OH)2 -D Αντιορός - - 300 μL 300 μL
ΣΗΜΕΙΩΣΗ: Οι σωλήνες Συνολικής μέτρησης και NSB δημιουργούνται με την
προσθήκη 50 μL αιθανόλης 95% με 125 μL ιχνηθέτη και διανομή με πιπέτα 75 μL του
μίγματος αυτού σε διπλούς σωλήνες προσδιορισμού.
3. Αναμίξτε καλά. Επωάστε επί 2 ώρες (±15 λεπτά) στους 20-25°C.
4. Διανέμετε 500 μL αντιδραστήριο καθίζησης GAR σε όλες τις υποδοχές, εκτός
από τους δοκιμαστικούς σωλήνες συνολικών μετρήσεων.
5. Αναμίξτε καλά. Επωάστε επί 20 λεπτά (±5 λεπτά) στους 20-25°C.
6. Φυγοκεντρήστε χρησιμοποιώντας 1800 x g* για 20 λεπτά στους 20 έως 25°C.
7. Μεταγγίστε τα υπερκείμενα.
8. Μετρήστε κάθε σωλήνα σε μετρητή γάμμα για 1 λεπτό.
*g = (1118 x 10-8) (ακτίνα σε εκατοστά) (rpm)2
155
REFERENCES/BIBLOGRAPHIE/LITERATUR/BIBLIOGRAFÍA/BIBLIOGRAFIA/
REFERENSER/SEZNAM LITERATURY/REFERANSER/ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑ
1. Haddad, J.G. and T.C.B. Stamp, “Circulating 25-Hydroxyvitamin D in Man,”
American Journal of Medicine, 57: 57, (1974).
2. Holick, M.F., “The Cutaneous Photosynthesis of Previtamin D3: A Unique Photoendocrine
System,” Journal of Investigative Dermatology, 76: 51, (1981).
3. Harrison, J.E., A.J.W. Hitchman, G. Jones, C.S. Tam and J.N.M. Heersche,
“Plasma Vitamin D Metabolite Levels in Phosphorus Deficient Rats During the
Development of Vitamin D Deficient Rickets,” Metabolism, 31 (11): 1121, (1982).
4. DeLuca, H.F., “The Vitamin D Systems: A View From Basic Science to the Clinic,”
Clinical Biochemistry, 14: 213, (1981).
5. Norman, A.W. and F.P. Roos, “Vitamin D Seco-Steroids: Unique Molecules with
Both Hormone and Possible Membranophilic Properties,” Life Science, 24: 759,
(1979).
6. DeLuca, H.F. and H.K. Schnoes, “Metabolism and Mechanism of Action of
Vitamin D,” Annual Reviews Biochemistry, 45: 631, (1976).
7. Aarskog, D., L. Aksnes and T. Markestad, “Effect of Parathyroid Hormone on
Vitamin D Metabolism in Osteoporosis,” Pediatrics, 68 (1): 109, (1981).
8. Chesney, R.W., “Current Clinical Applications of Vitamin D Metabolite Research,”
Clinical Orthopedics and Related Research, 161: 285, (1981).
9. Sorensen, O.H., B. Lumholtz, B. Lund, I. Hjelmstrand, L. Mosekilde, F. Melsen,
J.E. Bishop and A.W. Norman, “Acute Effects of Parathyroid Hormone on Vitamin
D Metabolism in Patients with the Bone Loss of Aging,” Journal of Clinical
Endocrinology and Metabolism, 54 (6): 1258, (1982).
10. Hollis, B.W., “Assay of Circulating 1,25-dihydroxyvitamin D Involving a Novel
Single-Cartridge Extraction and Purification Procedure,” Clinical Chemistry, 32
(11): 2060, (1986).
11. Lissner, D., R.S. Mason and S. Posen, “Stability of Vitamin D Metabolites in
Human Blood Serum and Plasma,” Clinical Chemistry, 27 (5): 773, (1981).
12. Tonks, D.B., “A Study of the Accuracy and Precision of Clinical Chemistry
Determinations in 170 Canadian Laboratories,” Clinical Chemistry, 9: 217,
(1963).
13. Rodbard, D., et. al., “Statistical Quality Control of Radioimmunoassays,” The
Journal of Clinical Endocrinology Metabolism, 28: 1412, (1968).
14. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Internal Quality Control
Testing: Principles and Definitions, Approved Guideline, CLSI document C24-A
(ISBN 1-56238-112-1), CLSI, 771 East Lancaster Avenue, Villanova, PA, 19085,
(1991).
15. National Committee for Clinical Laboratory Standards, “How to Define and
Determine Reference Intervals in the Clinical Laboratory, 2nd ed.” CLSI Document
C28-A2, 20(13) Approved Guideline, (2000).
16. National Committee for Clinical Laboratory Standards, “Evaluation of Precision
Performance of Clinical Chemistry Devices,” CLSI Document EP5-A, 19(2),
Approved Guideline, (1999).
17. National Committee for Clinical Laboratory Standards, “Evaluation of the Linearity
of Quantitative Analytical Methods: Performance of Clinical Chemistry Devices,”
CLSI Document EP6-P, 6(18), Proposed Guideline, (1996).
18. National Committee for Clinical Laboratory Standards, “Interference Testing in
Clinical Chemistry,” CLSI Document EP7-P, 6(13), Proposed Guideline, (1986).
156
SYMBOLS USED WITH DEVICES
English Français Deutsch Español Italiano
European
Conformity
Conformité aux
normes
européennes
CE – Konformitätskennzeichnung
Conformidad
europea
Conformità
europea
Expiration Date Date limite
d'utilisation
Mindesthaltbarkeits
datum
Fecha de
caducidad Data di scadenza
Manufacturer Fabricant Hersler Fabricante Fabbricante
Consult
Instructions
for Use
Consulter les
instructions
d’utilisation
Gebrauchsanweisu
ng beachten
Consulte las
instrucciones de
uso
Consultare le
istruzioni per l’uso
IVD
In vitro
diagnostic. Diagnostic in vitro. In-vitro-
Diagnostikum.
Diagnóstico in
vitro.
Diagnostica in
vitro.
Lot No. No. de lot Chargen-Nr. Número de lote Lotto n°
Maximum
temperature
Température
maximale Höchsttemperatur Temperatura
máxima
Temperatura
massima
Temperature
limitation.
Limitation de
température. Temperaturbereich Limitación de
temperatura
Limite della
temperatura
Antiserum Antisérum Antiserum Antisuero Antisiero
Precipitating
reagent Réactif précipitant Fällungsreagenz Reactivo
precipitante
Reagente
precipitante
Tracer: antigen
labelled with 125I
Traceur : antigène
marqué à l'iode 125
Tracer: 125Imarkiertes
Antigen
Trazador:
antígeno
etiquetado con
125I
Tracciatore:
antigene
etichettato con 125I
Buffer Tampon Puffer Tampón Tampone
Calibrator Étalon Kalibrator Calibrador Calibratore
Control serum Sérum de contrôle Kontrollserum Suero de control Siero di controllo
Reagent
Réactif Reagenz Reactivo Reagente
Radioactive Radioactif Radioaktiv Radiactivo Radioattivo
Highly
flammable
Facilement
inflammable Leichtentzündlich Fácilment
inflamable
Facilment
infiammabile
Harmful Nocif Mindergiftig Nocivo Nocivo
SYMBOLS USED WITH DEVICES CONTINUED ON NEXT PAGE.
157
CONTINUED FROM PREVIOUS PAGE - SYMBOLS USED WITH DEVICES
Svenska Česky Norsk Ελληνικά
Europeisk
överensstämmeise
Značka evropské
shody EU-konformitet Ευρωπαϊκή
Συμμόρφωση
Utgångsdatum Datum ukončení
použinosti Utløpsdato Ημερομηνία Λήξης
Tilverkare Výrobce Tilvirker Κατασκευαστής
Se
bruksanvisningen
Prostudujte návod k
použití
Se
Bruksanvisninger
Συμβουλευτείτε τις
Οδηγίες Χρήσης
IVD
Diagnostik in vitro. Diagnostický
prostředek in vitro
In vitrodiagnostikk.
In vitro διαγνωστικό
ιατροτεχνολογικό
προϊόν.
Batch-nummer Číslo šarže Partinr. Αρ. παρτίδας
Max. temperatur Maximální teplota Maksimumstemperatur
Μέγιστη
θερμοκρασία
Temperaturbegränsning.
Teplotní limit Temperaturbegrensninger
Περιορισμοί
θερμοκρασίας
Antiserum Antisérum Antiserum Αντιορός
Utfällningsreagens Precipitaèní
reagens
Utfellingsreagens
Αντιδραστήριο
καθίζησης
Spårelement:
antigen betecknad
med 125I
Izotopový indikátor:
antigen značený
125I
Sporstoff:
antigen merket
125I
Ιχνηθέτης: Αντιγόνο
σημασμένο με 125I
Buffert Pufr Buffer Ρυθμιστικό διάλυμα
Kalibrator Kalibrátor Kalibrator Βαθμονομητής
Kontrollserum Kontrolní sérum Kontrollserum Ορός μάρτυρα
Reagens Reagens Reagens Αντιδραστήριο
Radioaktiv Radioaktivní Radioaktiv Ραδιενεργό
Mycket brandfarligt Vysoce hořlavý Svært
brannfarlig Πολύ εύφλεκτο
Skadligt Zdraví škodlivýss Skadelig Επιβλαβής
158
For Customer Service in the
U.S. and Canada Call Toll Free:

DiaSorin Inc.
1951 Northwestern Avenue
P.O. Box 285
Stillwater, MN 55082-0285
DiaSorin S.p.A.,
13040 Saluggia (VC) Italy
In the United Kingdom Call:
+44(0) 1344 401 430
+44(0) 7884 050812
Phone: 651-439-9710
651-351-5669
34691
13161E 7/10
PRINTED IN U.S.A.